Title (eng)
Stat5 in Erythropoiesis and iron metabolism
Parallel title (deu)
Stat5 in Erythropoese und Eisen Metabolismus
Author
Helmuth Gehart
Advisor
Ernst Müllner
Assessor
Ernst Müllner
Abstract (deu)
Signal Transducer and Activator of Transcription 5 (STAT5) ist ein wesentlicher Effektor der Erythropoietin (EPO) Signaltransduktion in der erythroiden Differenzierung. Erstmals wurde eine vollständige phänotypische Analyse im erythroiden Kompartiment von Mäusen durchgeführt, denen beide Stat5 Isoformen (STAT5a und STAT5b) komplett fehlen. Der beobachtete Phänotyp der hypochromen mikrocytären Anämie und die daraus resultierende perinatale Letalität führten nicht nur zur Bestätigung von bekannten STAT5 Funktionen, wie Schutz vor Apoptose, sondern auch zur Entdeckung neuer STAT5 Rollen in der Eisen-Aufnahme und Häm-Biosynthese.
Anämie von Stat5 defizienten Mäusen konnte auf erhöhte Apoptose im Erythron durch verringerte Expression des anti-apoptotischen Proteins BCL-XL und Verlust des anti-apoptotischen Proteins MCL1 zurückgeführt werden. Da jedoch Apoptose allein nicht zu hypochromen oder mikrocytären Phänotypen führt, zeigte die Suche nach weiteren Defekten Eisenmangel in Stat5 defizienten erythroiden Zellen. Der Mangel an zellulärem Eisen konnte durch reduzierte Expression von Transferrin-Rezeptor 1 (TFR1), der wichtigsten Komponente der zellulären Eisen-Aufnahme, erklärt werden. TFR1 Expression wird sowohl auf transkriptioneller als auch auf posttranskriptioneller Ebene gestört. Einerseits ist Tfr1 ein direktes Ziel-Gen von STAT5, was zu eingeschränkter transkriptioneller Aktivität in der Knock-out-Situation führt. Andererseits wird im Stat5 Knockout Tfr1 mRNA-Stabilität durch verringerte Expression des Iron Regulatory Protein 2 (IRP2) vermindert, das bestimmte Sequenzen im 3 'UTR der Tfr1 mRNA bindet, was Schutz vor Degradation bietet, wenn zelluläres Eisen rar ist. Reduzierte Tfr1 mRNA Transkription und Stabilität führen zu verringerter TFR1 Oberflächenexpression, verringerter zellulärer Eisen-Aufnahme und schließlich zu Problemen in der Häm-Synthese, jenem Prozess mit dem höchsten Eisen Bedarf in differenzierenden erythroiden Zellen. Drastisch reduzierte Häm-Synthese führt wiederum durch die langsame Hämoglobin Akkumulation zu hypochromer microcytärer Anämie.
In-vitro-Differenzierung von Stat5-Knockout Erythroblasten kann nicht durch direkte Eisenzugabe unter Umgehung des TFR1 Defekts gerettet werden. Daher müssen auch andere Mechanismen betroffen sein, die Hämoglobin Akkumulation behindern. Es konnte gezeigt werden, dass vier der acht Häm-Biosynthese Enzyme in Abwesenheit von STAT5 herunter reguliert waren. Vor allem die Expression von δ-Amino-Levulinic Acid Synthase 2 (ALAS2), dem geschwindigkeitsbestimmenden Enzym im Syntheseweg, war sowohl auf mRNA als auch auf Protein Ebene stark vermindert. Da sich alle vier enzymatischen Gene als unwahrscheinliche direkte STAT5 Ziele erwiesen, wurde der Status des gesamten hämatopoetischen transkriptionellen Netzwerks in Stat5-/- Erythroblasten ermittelt. Knockout Erythroblasten hatten stark erhöhte Ldb1 und Gata2 mRNA Niveaus. Von beiden Genen ist bekannt, dass sie bei Überexpression erythroide Differenzierung durch Interferenz mit GATA-1-Aktivität negativ beeinflussen. Da in den Promotoren von allen vier herunter regulierten Häm-Biosynthese Enzymen GATA-1 Bindungsstellen gefunden wurden, kann der Mangel an Häm-Synthese auf die erhöhte Expression von LDB1 und GATA2 zurückgeführt werden.
Im Vergleich zu Erythropoetin und Erythropoetin-Rezeptor (EpoR) Knockouts, hat Verlust von Stat5 einen milderen Phänotyp. Dieser Unterschied könnte aus partieller Kompensation durch andere STAT-Familienmitglieder mit sehr ähnlichen Ziel DNASequenzen, wie STAT3, resultieren. Erhöhte Phosphorylierungsniveaus von STAT3 wurden in Stat-defizienten Erythroblasten gemessen, in denen dieser Effekt durch Verlust von Cytokine-Inducible-SH2 Protein (CIS), Suppressor Of Cytokine Signaling 1 (SOCS1) und Suppressor Of Cytokine Signaling 3 (SOCS3), die wichtige Negativregulatoren der EPOR Signaltransduktion sind, erklärt werden konnte. Im Gegensatz dazu zeigt eine anderen Familie von Negativregulatoren, Protein Inhibitors of Activated STAT (PIAS Proteins), deutlich erhöhte mRNA-Niveaus, was, mit hoher Wahrscheinlichkeit, erhöhter STAT Aktivität infolge des Verlusts von SOCS-Proteinen entgegenwirkt. Obwohl weitere funktionelle Experimente nötig sind, um kompensatorische Wirkungen zu untersuchen, können diese Ergebnisse die nicht notwendigerweise funktionelle, erhöhte Phosphorylierung von STAT3 in Stat5 defizienten Erythroblasten und anderen Geweben erklären.
Abstract (eng)
Signal transducer and activator of transcription 5 (STAT5) is an essential downstream effector of erythropoietin (EPO) mediated signaling in erythroid differentiation. We conducted the first full phenotypical analysis in the erythroid compartment of mice completely lacking both Stat5 isoforms (Stat5a and Stat5b). The observed phenotype of hypochromic microcytic anemia and perinatal lethality led to the confirmation of known STAT5 functions, like apoptosis protection, but also to the discovery of novel STAT5 roles in iron uptake and heme biosynthesis.
Anemia of Stat5 deficient mice could be attributed to increased apoptosis in the erythron caused by decreased expression of the anti-apoptotic protein BCL-XL and loss of the anti-apoptotic protein MCL1. Since apoptosis alone does not explain the emergence of hypochromic or microcytic erythrocytes additional defects were suspected. This led to the finding of iron deficiency in Stat5 deficient erythroid cells. Lack of cellular iron could be traced back to reduced expression of transferrin receptor 1 (TFR1), the main player in cellular iron uptake. TFR1 regulation was found to be disturbed both at transcriptional and posttranscriptional level. On the one hand Tfr1 is a direct STAT5 target with reduced transcriptional activity in the knockout situation. Tfr1 mRNA stability, on the other hand, is impaired in knockouts due to decreased expression of iron regulatory protein 2 (IRP2), which binds several sequence elements in the 3’ UTR of Tfr1 mRNA to protect it from degradation, when cellular iron is scarce. Reduced Tfr1 mRNA transcription and stability leads to decreased TFR1 surface expression, diminished cellular iron uptake and finally to problems in heme synthesis, the process with the highest iron demand in differentiating erythroid cells. Drastically reduced heme synthesis carries over to diminished hemoglobin accumulation, which in turn causes hypochromic microcytic anemia.
In vitro differentiation of Stat5 knockout erythroblasts cannot be rescued by supplying cells with iron complexes bypassing their TFR1 defect. Therefore additional mechanisms must be affected by loss of Stat5 that hinder hemoglobin accumulation. Indeed, four out of eight enzymes involved in heme biosynthesis were found to be downregulated in the absence of STAT5. Most importantly δ-aminolevulinic acid synthase 2 (ALAS2), the rate limiting enzyme in the pathway, displayed severely reduced mRNA and protein levels. Since all four genes were unlikely to be direct STAT5 targets, the status of the hematopoietic transcriptional network in Stat5-/- erythroblasts was surveyed further. Knockout erythroblasts had highly elevated levels of Ldb1 and Gata2 mRNA, both known to interfere with erythroid differentiation by negatively affecting GATA1 activity. Since GATA1 binding sites are present in the promoters of all four downregulated heme biosynthetic enzymes, the lack of heme synthesis may be linked to increased expression of LDB1 and GATA2.
In comparison to ablation of erythropoietin (Epo) and erythropoietin receptor (EpoR) knockouts, loss of Stat5 has a milder phenotype. This difference may be attributed to partial rescue by other STAT family members with similar DNA-binding consensus sequences like STAT3. Higher levels of phosphorylated STAT3 were indeed observed in Stat5 deficient erythroblasts, which could be traced back to loss of cytokine-inducible-SH2-containing protein (CIS), suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1) and suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3), which constitute important negative regulators of EPOR signaling. In contrast another family of negative regulators, protein inhibitors of activated STAT (PIAS) proteins, displayed significantly elevated mRNA levels, counteracting increased STAT activity due to loss of SOCS proteins. Although further functional experiments are needed to clarify compensatory effects, these findings may help to explain the elevated levels of STAT3 phosphorylation found in erythroblasts and other tissues lacking Stat5.
Keywords (eng)
ErythropoiesisHemeAnemiaIronSTAT5TFR1IRP2MCL1SOCSPIAS
Keywords (deu)
ErythropoeseHämAnämieEisenSTAT5TFR1IRP2MCL1SOCSPIAS
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1251316
rdau:P60550 (deu)
VIII, 117 S. : Ill., graph. Darst.
Number of pages
127
Association (deu)
Title (eng)
Stat5 in Erythropoiesis and iron metabolism
Parallel title (deu)
Stat5 in Erythropoese und Eisen Metabolismus
Author
Helmuth Gehart
Abstract (deu)
Signal Transducer and Activator of Transcription 5 (STAT5) ist ein wesentlicher Effektor der Erythropoietin (EPO) Signaltransduktion in der erythroiden Differenzierung. Erstmals wurde eine vollständige phänotypische Analyse im erythroiden Kompartiment von Mäusen durchgeführt, denen beide Stat5 Isoformen (STAT5a und STAT5b) komplett fehlen. Der beobachtete Phänotyp der hypochromen mikrocytären Anämie und die daraus resultierende perinatale Letalität führten nicht nur zur Bestätigung von bekannten STAT5 Funktionen, wie Schutz vor Apoptose, sondern auch zur Entdeckung neuer STAT5 Rollen in der Eisen-Aufnahme und Häm-Biosynthese.
Anämie von Stat5 defizienten Mäusen konnte auf erhöhte Apoptose im Erythron durch verringerte Expression des anti-apoptotischen Proteins BCL-XL und Verlust des anti-apoptotischen Proteins MCL1 zurückgeführt werden. Da jedoch Apoptose allein nicht zu hypochromen oder mikrocytären Phänotypen führt, zeigte die Suche nach weiteren Defekten Eisenmangel in Stat5 defizienten erythroiden Zellen. Der Mangel an zellulärem Eisen konnte durch reduzierte Expression von Transferrin-Rezeptor 1 (TFR1), der wichtigsten Komponente der zellulären Eisen-Aufnahme, erklärt werden. TFR1 Expression wird sowohl auf transkriptioneller als auch auf posttranskriptioneller Ebene gestört. Einerseits ist Tfr1 ein direktes Ziel-Gen von STAT5, was zu eingeschränkter transkriptioneller Aktivität in der Knock-out-Situation führt. Andererseits wird im Stat5 Knockout Tfr1 mRNA-Stabilität durch verringerte Expression des Iron Regulatory Protein 2 (IRP2) vermindert, das bestimmte Sequenzen im 3 'UTR der Tfr1 mRNA bindet, was Schutz vor Degradation bietet, wenn zelluläres Eisen rar ist. Reduzierte Tfr1 mRNA Transkription und Stabilität führen zu verringerter TFR1 Oberflächenexpression, verringerter zellulärer Eisen-Aufnahme und schließlich zu Problemen in der Häm-Synthese, jenem Prozess mit dem höchsten Eisen Bedarf in differenzierenden erythroiden Zellen. Drastisch reduzierte Häm-Synthese führt wiederum durch die langsame Hämoglobin Akkumulation zu hypochromer microcytärer Anämie.
In-vitro-Differenzierung von Stat5-Knockout Erythroblasten kann nicht durch direkte Eisenzugabe unter Umgehung des TFR1 Defekts gerettet werden. Daher müssen auch andere Mechanismen betroffen sein, die Hämoglobin Akkumulation behindern. Es konnte gezeigt werden, dass vier der acht Häm-Biosynthese Enzyme in Abwesenheit von STAT5 herunter reguliert waren. Vor allem die Expression von δ-Amino-Levulinic Acid Synthase 2 (ALAS2), dem geschwindigkeitsbestimmenden Enzym im Syntheseweg, war sowohl auf mRNA als auch auf Protein Ebene stark vermindert. Da sich alle vier enzymatischen Gene als unwahrscheinliche direkte STAT5 Ziele erwiesen, wurde der Status des gesamten hämatopoetischen transkriptionellen Netzwerks in Stat5-/- Erythroblasten ermittelt. Knockout Erythroblasten hatten stark erhöhte Ldb1 und Gata2 mRNA Niveaus. Von beiden Genen ist bekannt, dass sie bei Überexpression erythroide Differenzierung durch Interferenz mit GATA-1-Aktivität negativ beeinflussen. Da in den Promotoren von allen vier herunter regulierten Häm-Biosynthese Enzymen GATA-1 Bindungsstellen gefunden wurden, kann der Mangel an Häm-Synthese auf die erhöhte Expression von LDB1 und GATA2 zurückgeführt werden.
Im Vergleich zu Erythropoetin und Erythropoetin-Rezeptor (EpoR) Knockouts, hat Verlust von Stat5 einen milderen Phänotyp. Dieser Unterschied könnte aus partieller Kompensation durch andere STAT-Familienmitglieder mit sehr ähnlichen Ziel DNASequenzen, wie STAT3, resultieren. Erhöhte Phosphorylierungsniveaus von STAT3 wurden in Stat-defizienten Erythroblasten gemessen, in denen dieser Effekt durch Verlust von Cytokine-Inducible-SH2 Protein (CIS), Suppressor Of Cytokine Signaling 1 (SOCS1) und Suppressor Of Cytokine Signaling 3 (SOCS3), die wichtige Negativregulatoren der EPOR Signaltransduktion sind, erklärt werden konnte. Im Gegensatz dazu zeigt eine anderen Familie von Negativregulatoren, Protein Inhibitors of Activated STAT (PIAS Proteins), deutlich erhöhte mRNA-Niveaus, was, mit hoher Wahrscheinlichkeit, erhöhter STAT Aktivität infolge des Verlusts von SOCS-Proteinen entgegenwirkt. Obwohl weitere funktionelle Experimente nötig sind, um kompensatorische Wirkungen zu untersuchen, können diese Ergebnisse die nicht notwendigerweise funktionelle, erhöhte Phosphorylierung von STAT3 in Stat5 defizienten Erythroblasten und anderen Geweben erklären.
Abstract (eng)
Signal transducer and activator of transcription 5 (STAT5) is an essential downstream effector of erythropoietin (EPO) mediated signaling in erythroid differentiation. We conducted the first full phenotypical analysis in the erythroid compartment of mice completely lacking both Stat5 isoforms (Stat5a and Stat5b). The observed phenotype of hypochromic microcytic anemia and perinatal lethality led to the confirmation of known STAT5 functions, like apoptosis protection, but also to the discovery of novel STAT5 roles in iron uptake and heme biosynthesis.
Anemia of Stat5 deficient mice could be attributed to increased apoptosis in the erythron caused by decreased expression of the anti-apoptotic protein BCL-XL and loss of the anti-apoptotic protein MCL1. Since apoptosis alone does not explain the emergence of hypochromic or microcytic erythrocytes additional defects were suspected. This led to the finding of iron deficiency in Stat5 deficient erythroid cells. Lack of cellular iron could be traced back to reduced expression of transferrin receptor 1 (TFR1), the main player in cellular iron uptake. TFR1 regulation was found to be disturbed both at transcriptional and posttranscriptional level. On the one hand Tfr1 is a direct STAT5 target with reduced transcriptional activity in the knockout situation. Tfr1 mRNA stability, on the other hand, is impaired in knockouts due to decreased expression of iron regulatory protein 2 (IRP2), which binds several sequence elements in the 3’ UTR of Tfr1 mRNA to protect it from degradation, when cellular iron is scarce. Reduced Tfr1 mRNA transcription and stability leads to decreased TFR1 surface expression, diminished cellular iron uptake and finally to problems in heme synthesis, the process with the highest iron demand in differentiating erythroid cells. Drastically reduced heme synthesis carries over to diminished hemoglobin accumulation, which in turn causes hypochromic microcytic anemia.
In vitro differentiation of Stat5 knockout erythroblasts cannot be rescued by supplying cells with iron complexes bypassing their TFR1 defect. Therefore additional mechanisms must be affected by loss of Stat5 that hinder hemoglobin accumulation. Indeed, four out of eight enzymes involved in heme biosynthesis were found to be downregulated in the absence of STAT5. Most importantly δ-aminolevulinic acid synthase 2 (ALAS2), the rate limiting enzyme in the pathway, displayed severely reduced mRNA and protein levels. Since all four genes were unlikely to be direct STAT5 targets, the status of the hematopoietic transcriptional network in Stat5-/- erythroblasts was surveyed further. Knockout erythroblasts had highly elevated levels of Ldb1 and Gata2 mRNA, both known to interfere with erythroid differentiation by negatively affecting GATA1 activity. Since GATA1 binding sites are present in the promoters of all four downregulated heme biosynthetic enzymes, the lack of heme synthesis may be linked to increased expression of LDB1 and GATA2.
In comparison to ablation of erythropoietin (Epo) and erythropoietin receptor (EpoR) knockouts, loss of Stat5 has a milder phenotype. This difference may be attributed to partial rescue by other STAT family members with similar DNA-binding consensus sequences like STAT3. Higher levels of phosphorylated STAT3 were indeed observed in Stat5 deficient erythroblasts, which could be traced back to loss of cytokine-inducible-SH2-containing protein (CIS), suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1) and suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3), which constitute important negative regulators of EPOR signaling. In contrast another family of negative regulators, protein inhibitors of activated STAT (PIAS) proteins, displayed significantly elevated mRNA levels, counteracting increased STAT activity due to loss of SOCS proteins. Although further functional experiments are needed to clarify compensatory effects, these findings may help to explain the elevated levels of STAT3 phosphorylation found in erythroblasts and other tissues lacking Stat5.
Keywords (eng)
ErythropoiesisHemeAnemiaIronSTAT5TFR1IRP2MCL1SOCSPIAS
Keywords (deu)
ErythropoeseHämAnämieEisenSTAT5TFR1IRP2MCL1SOCSPIAS
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1251317
Number of pages
127
Association (deu)
License
Citable links
Other links
Managed by
Details
Metadata
Export formats
Universitätsring 1, 1010 Wien | T
T +43-1-4277-0