Structure and function of P-glycoprotein

Sandra Pferschy

doi:10.25365/thesis.7647

You are here: University of Vienna PHAIDRA Detail o:1262396

Title (eng)

Structure and function of P-glycoprotein

Parallel title (deu)

Struktur und Funktion von P-Glykoprotein

Author

Sandra Pferschy

Advisor

Peter Chiba

Assessor

Walter Berger

Balázs Sarkadi

Abstract (deu)

Das humane „multidrug resistance“ P-Glycoprotein, welches durch das MDR1 Gen kodiert wird, gehört zu der Familie der ATP-binding cassette (ABC) Transporter, die unter ATP-Verbrauch zelltoxische, strukturell nicht näher verwandte Stoffe aus der Zelle pumpt. Dieses Protein hat klinisch eine große Bedeutung aufgrund des Phänomens der zellulären Resistenz gegen viele Wirkstoffe, auch „multidrug resistance“ genannt. Resistenzen gegen verschiedene Medikamente sind eines der Hauptprobleme in der Behandlung von Krebs. Das P-Glycoprotein besteht aus zwei homologen Hälften, die durch einen Linker miteinander verbunden sind. Jede Hälfte besteht aus einer Transmembrandomäne, die sechs Transmembransegmente besitzt, und einer hydrophilen Nukleotidbindungsdomäne, der Nukleotidbindungsstelle. Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung und Charakterisierung von TMD1/TMD2 Kontakt-Interface-Aminosäurenresten, die eine wichtige Rolle beim Transport von löslichen Substanzen spielen. Funktionelle Untersuchungen wurden mit P-gp Mutanten durchgeführt, deren TMD1/TMD2 Kontakt-Interface-Aminosäuren mittels zielgerichteter Mutagenese zu anderen Resten außer Cystein mutiert wurden. Die zielgerichtete Mutagenese basierte auf „overlap extension“ Polymerase-Kettenreaktion (OE-PCR). Das Mutationskonzept wurde durch Photoaffinitätsmarkierung, vorhandene Proteinhomologiemodelle, in-silico Vorhersage von wichtigen Aminosäure-Resten mittels der „real valued evolutionary trace“ Methode und „data-driven docking“, basierend auf Daten von vorhergegangenen zielgerichteten Mutationen, gesteuert. Diesen Erkenntnissen zufolge wurden P-gp Mutanten hergestellt, die Aminosäure-Reste besitzen, die vom Protein toleriert werden, um eine hohe Anzahl von richtig gefalteten und funktionellen Transportern zu erhalten. Die Glutaminreste Q132 (TM2) in der N-terminalen Hälfte und Q773 (TM8) in der C-terminalen Hälfte wurden in Betracht gezogen. P-gp Homologiemodelle zeigen, dass diese beiden Q-Reste in der Nähe von stark photomarkierten Resten im TM2/11 Interface und im contralateralen TM5/8 Interface liegen. In einigen Tierarten ist einer der beiden Q-Reste zu R oder E mutiert, was darauf hinweist, dass eine Ladung in dieser Position im Protein toleriert wird. Deshalb wurde Q132 zu Q132A, Q132E und Q132R, und Q773 zu Q773A, Q773E und Q773R mutiert. Zusätzlich wurden die Doppelmutanten Q132A/Q773A, Q132E/Q773E und Q132R/Q773R generiert. Alle Mutanten wurden mittels Efflux-Studien, MRK16 Färbungen und Toxizitätstests charakterisiert. Die Q773R Mutante zeigte für das Substrat Rhodamin 123 einen mangelhaften Transport, während sowohl die Q773E Mutante als auch die Q773A Mutante einen aktiven Transport aufwiesen. Ein unbeeinträchtigten Rhodamin 123 Transport konnte für die A, E und R Mutanten in der Position 132 gezeigt werden. Die Q132R/Q773R Doppelmutante war wenig aktiv.

Abstract (eng)

The human multidrug resistance P-glycoprotein (P-gp), the product of the MDR1 gene, is an ATP-binding cassette (ABC) protein that uses ATP to transport a variety of cytotoxic compounds without a common structure or intracellular target, out of the cell. The protein is clinically important since it contributes to the phenomenon of multidrug resistance during chemotherapy of human cancers. It has two homologous halves that are joined by a linker. Each half consists of a hydrophobic transmembrane domain containing six transmembrane (TM) segments and a hydrophilic nucleotide-binding domain (NBD) containing the nucleotide binding site. The aim of this project was the identification and characterization of TMD1/TMD2 contact interface residues, which are important for transport of solutes. Functional assays were performed with P-gp mutants, in which the TMD1/TMD2 contact interface residues were mutated to residues other than cysteine by site directed mutagenesis based on overlap extension polymerase chain reaction (OE-PCR). The mutational concept was guided by photoaffinity labeling, availability of protein homology models, in-silico importance prediction of residues by real valued evolutionary trace and data-driven docking results based on previous site-directed mutagenesis data. Thus, hypothesis driven generation of P-gp mutants with amino acid residues that will be tolerated in the protein to obtain a high number of correctly targeted and functional transporters was performed. The glutamine residues Q132 (TM2) in the N-terminal half and Q773 (TM8) in the C-terminal half of P-gp were found in predicted TM segments. Homology models of P-gp suggested that these Q-residues are located between highly photolabelled residues at the TM2/11 interface and the contralateral TM5/8 interface. In some species one of these Q residues is mutated to R or E, indicating that a charge is tolerated in this position of the protein. Thus, Q132 was mutated to Q132A, Q132E and Q132R, and Q773 was mutated to Q773A, Q773E and Q773R. In addition Q132A/Q773A, Q132E/Q773E and Q132R/Q773R double mutants were generated. Mutants were characterized using efflux studies, MRK16 staining and cytotoxicity assays. The Q773R mutant was deficient for rhodamine 123 transport, while the Q773E and Q773A mutants were active. Similarly the A, E and R mutants in position 132 showed unimpaired rhodamine 123 transports. The Q132R/Q773R double mutant was also transport deficient.

Keywords (eng)