Title (eng)
A novel transcriptional termination signal capable to terminate T7 polymerase mediated transcription more efficiently
Parallel title (eng)
Ein neuartiges Terminationssignal verbessert die Termination der T7 Polymerase vermittelten Transkription
Author
Alexander Wittwer
Advisor
Angela Witte
Assessor
Angela Witte
Abstract (deu)
Bis heute ist E. coli der am häufigsten eingesetzte Wirtsorganismus und Plasmid basierende Expressionssyteme finden noch immer weite Verbreitung. Die meisten Systeme basieren auf genetischen Elementen, die ursprünglich vom Bakteriophagen T7 stammen. Das kommerziell vertriebene pET Expressionssytem erfreut sich immer größerer Beliebtheit und war auch Gegenstand dieser Arbeit. Die zugrunde liegende Arbeit ist um eine Verbesserung des Plasmid basierenden pET Systems bemüht. Ziel der Bestrebungen war es die transkriptionelle Termination am Plasmid kodierten T7 Terminator (TE 80%) zu steigern. Dabei zeigte eine Kombination aus einem künstlich hergestellten T7 Abkömmling mit zwei bereits bekannten intrinsischen Terminatoren (rrnBT1 und T7) eine bemerkenswerte Erhöhung der Terminationseffizienz (TE). Diese neuartige Terminationsregion wurde tZENIT Region genannt und zeigte ein TE von nahezu 100% auf. Um nun mögliche Auswirkungen eines verbesserten Terminationssignales auf Aspekte wie Produktausbeute und Systemstabilität zu bestimmen, wurden mehrere fed batch Kultivierungen durchgeführt. Die Fermentation eines E. coli HMS174(DE3) Produktionsstammes, welcher einen pET30a Vektor mit der entsprechenden tZENIT Region enthielt, zeigte unter Standardbedienungen eine drastische Reduzierung der Plasmidkopienzahl (PCN) pro Zelle und dieser erniedrigte Level an plasmidischer DNA wurde über den gesamten Prozess aufrecht erhalten. Der selbe Produktionsstamm wurde einer weiteren Kultivierung unter reduzierter Induktionsstärke unterzogen. Die daraus resultierenden Ergebnisse zeigten neben der bereits beobachteten PCN Reduktion auch eine deutliche Steigerung des spezifischen Produktgehaltes, und die Wirtszellen waren in der Lage weit höhere Zelldichten zu erreichen. All diese hinsichtlich einer Produktsteigerung positiven Effekte führten schlussendlich zu einer deutlichen Erhöhung des Ertrages an rekombinanten Protein.
Abstract (eng)
For many reasons E. coli is still one of the widely used hosts for recombinant protein production and plasmid based expression systems are very common. Most of the expression systems rely on genetic elements originally stemming from bacteriophage T7 and the commercially available pET30a system has gained increasing popularity in recent years. The key objective of the underlying work was the increase of transcriptional termination occurring at the plasmid encoded T7 terminator (TE of 80%) in order to further improve the efficiency of recombinant plasmid encoded protein production. The combination of an altered artificially synthesised T7 termination signal with two well known transcriptional terminators (rrnBT1 and T7) showed a remarkable increase of termination efficiency (TE). That novel termination region was called tZENIT and revealed a TE of nearly 100%. To characterize putative effects of an enhanced termination signal on product yield and process stability, several fed batch cultivations were carried out. Fermentation of a E. coli HMS174(DE3) strain carrying a pET30a derivative containing the tZENIT region showed a tremendous decrease of plasmid copy number (PCN) under standard conditions. That reduced plasmid level was maintained over the whole process. Bioreactor cultivation of the same production strain operated under reduced induction strength putatively revealed higher specific production rates and an increase of cell densities, both resulting in a higher yield of recombinant protein.
Keywords (eng)
T7 polymerasetranscriptional terminationtermination efficiency (TE)rrnBT1plasmid copy number (PCN)ColE1recombinant protein productionbioreactor cultivationpET30a
Keywords (deu)
T7 Polymerasetranskriptionelle TerminationTerminationseffizienz (TE)rrnBT1Plasmidkopienzahl (PCN)ColE1rekombinante ProteinexpressionBioreaktorkultivierungpET30a
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
Extent (deu)
107 S.
Number of pages
107
Association (deu)
Title (eng)
A novel transcriptional termination signal capable to terminate T7 polymerase mediated transcription more efficiently
Parallel title (eng)
Ein neuartiges Terminationssignal verbessert die Termination der T7 Polymerase vermittelten Transkription
Author
Alexander Wittwer
Abstract (deu)
Bis heute ist E. coli der am häufigsten eingesetzte Wirtsorganismus und Plasmid basierende Expressionssyteme finden noch immer weite Verbreitung. Die meisten Systeme basieren auf genetischen Elementen, die ursprünglich vom Bakteriophagen T7 stammen. Das kommerziell vertriebene pET Expressionssytem erfreut sich immer größerer Beliebtheit und war auch Gegenstand dieser Arbeit. Die zugrunde liegende Arbeit ist um eine Verbesserung des Plasmid basierenden pET Systems bemüht. Ziel der Bestrebungen war es die transkriptionelle Termination am Plasmid kodierten T7 Terminator (TE 80%) zu steigern. Dabei zeigte eine Kombination aus einem künstlich hergestellten T7 Abkömmling mit zwei bereits bekannten intrinsischen Terminatoren (rrnBT1 und T7) eine bemerkenswerte Erhöhung der Terminationseffizienz (TE). Diese neuartige Terminationsregion wurde tZENIT Region genannt und zeigte ein TE von nahezu 100% auf. Um nun mögliche Auswirkungen eines verbesserten Terminationssignales auf Aspekte wie Produktausbeute und Systemstabilität zu bestimmen, wurden mehrere fed batch Kultivierungen durchgeführt. Die Fermentation eines E. coli HMS174(DE3) Produktionsstammes, welcher einen pET30a Vektor mit der entsprechenden tZENIT Region enthielt, zeigte unter Standardbedienungen eine drastische Reduzierung der Plasmidkopienzahl (PCN) pro Zelle und dieser erniedrigte Level an plasmidischer DNA wurde über den gesamten Prozess aufrecht erhalten. Der selbe Produktionsstamm wurde einer weiteren Kultivierung unter reduzierter Induktionsstärke unterzogen. Die daraus resultierenden Ergebnisse zeigten neben der bereits beobachteten PCN Reduktion auch eine deutliche Steigerung des spezifischen Produktgehaltes, und die Wirtszellen waren in der Lage weit höhere Zelldichten zu erreichen. All diese hinsichtlich einer Produktsteigerung positiven Effekte führten schlussendlich zu einer deutlichen Erhöhung des Ertrages an rekombinanten Protein.
Abstract (eng)
For many reasons E. coli is still one of the widely used hosts for recombinant protein production and plasmid based expression systems are very common. Most of the expression systems rely on genetic elements originally stemming from bacteriophage T7 and the commercially available pET30a system has gained increasing popularity in recent years. The key objective of the underlying work was the increase of transcriptional termination occurring at the plasmid encoded T7 terminator (TE of 80%) in order to further improve the efficiency of recombinant plasmid encoded protein production. The combination of an altered artificially synthesised T7 termination signal with two well known transcriptional terminators (rrnBT1 and T7) showed a remarkable increase of termination efficiency (TE). That novel termination region was called tZENIT and revealed a TE of nearly 100%. To characterize putative effects of an enhanced termination signal on product yield and process stability, several fed batch cultivations were carried out. Fermentation of a E. coli HMS174(DE3) strain carrying a pET30a derivative containing the tZENIT region showed a tremendous decrease of plasmid copy number (PCN) under standard conditions. That reduced plasmid level was maintained over the whole process. Bioreactor cultivation of the same production strain operated under reduced induction strength putatively revealed higher specific production rates and an increase of cell densities, both resulting in a higher yield of recombinant protein.
Keywords (eng)
T7 polymerasetranscriptional terminationtermination efficiency (TE)rrnBT1plasmid copy number (PCN)ColE1recombinant protein productionbioreactor cultivationpET30a
Keywords (deu)
T7 Polymerasetranskriptionelle TerminationTerminationseffizienz (TE)rrnBT1Plasmidkopienzahl (PCN)ColE1rekombinante ProteinexpressionBioreaktorkultivierungpET30a
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
Number of pages
107
Association (deu)
License
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Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1265140Handle
https://hdl.handle.net/11353/10.1265140URN
https://nbn-resolving.org/nbn:at:at-ubw:1-29964.22606.427570-6 - Other links
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