Title (eng)
Investigation of high-performance liquid chromatography methods for the analysis of protein N-glycans
Parallel title (deu)
Untersuchung von Hochleistungs-Flüssigchromatographie-Methoden zur Analyse von Protein N-Glykanen
Author
Michael Melmer
Advisor
Wolfgang Lindner
Assessor
Andreas Rizzi
Christian Huber
Abstract (deu)
Biopharmazeutika sind aus einigen Bereichen der modernen Medizin kaum noch wegzudenken.
Während die Herstellung vergleichsweise einfacher Biomoleküle, wie z.B. des Peptids Insulin,
mittlerweile Routine ist, stellt die Expression komplexer Proteine immer noch eine große
Herausforderung für die Biotechnologie bzw. die biopharmazeutische Industrie dar. Oft sind posttranslationale
Modifikationen der Proteine erforderlich, damit diese eine entsprechende Wirkung
zeigen.
Glykosylierung ist eine der häufigsten post-translationalen Modifikationen in eukaryotischen
Zellen. Deshalb ist es nicht überraschend, dass auch Glykoproteine als Biopharmazeutika
Anwendung finden, wie z.B. Erythropoietin, Interferone, Fibrinogen, sowie eine Reihe von
monoklonalen Antikörpern. Dass die Glykosylierung Einfluss auf die Wirksamkeit und auch die
Verträglichkeit hat, ist gut dokumentiert.
Da die Glykosylierung von Proteinen im Gegensatz zur Protein- und zur Nukleinsäurebiosynthese
nicht nach einer Vorlage erfolgt, sondern durch das Zusammenspiel einer Vielzahl an Enzymen
zustande kommt, weist sie in der Regel eine recht heterogene Zusammensetzung auf. Die
vorkommenden Glykane, sowie deren Verhältnisse sind wichtige Parameter, die analysiert werden
müssen um die Stabilität des Herstellprozesses, sowie die Sicherheit und Wirksamkeit des Produkts
sicherzustellen.
Für die Analyse der Glykosylierung kommen eine Reihe von Analysemethoden zur Anwendung,
wobei die Analyse von freien, mit Fluoreszenzfarbstoff gelabeleten Glykanen mittels
Hochleistungs-Flüssigchromatographie (high-performance liquid chromatography, HPLC) als
Referenzmethode gilt. Als stationäre Phasen stehen Umkehrphasen (reversed phase
chromatography, RPC), hydrophile Wechselwirkungsphasen (hydrophilic interaction
chromatography, HILIC) und poröser, graphitähnlicher Kohlenstoff (porous graphitic carbon,
PGC) zur Verfügung. Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag auf der letztgenannten Option.
Zwei Publikationen befassen sich mit dem Retentionsmechanismus von Oligosacchariden auf PGC.
Die Untersuchungen zeigen, dass das organische Lösungsmittel in der mobilen Phase den
Wechselwirkungsmechanismusstark beeinflusst. Besondere Eigenschaften weist vor allem
Acetonitril auf. Weiters wurde der Einfluss der Temperatur des Säulenofens als wichtiger Parameter
für die Selektivität identifiziert. Schließlich wird der Effekt von Oxidations- und Reduktionsmitteln
- 92 -
auf die Retention von neutralen Glykanen gezeigt. Die Oxidation von PGC verhinderte außerdem
die Elution eines sauren Glykans vollständig, was für eine Polarisation der Oberfläche durch das
Reagens spricht. Die Auswirkungen der Reduktions- und Oxidationsmittel wird in der zweiten
Publikation ausführlich diskutiert.
Eine weitere Publikation beschäftigt sich mit der Etablierung einer vollständigen Analysemethode
für Glykane von therapeutischen Antikörpern. Die Glykane werden enzymatisch abgespalten, mit
einem Fluoreszenzfarbstoff gelabelts, mittels HILIC getrennt und durch Fluoreszenzdetektion
quantifiziert. Besondere Aufmerksamkeit lag auf der Probenvorbereitung, die mehrere Schritte
umfasst und dahingehend optimiert wurde die Integrität der ursprünglichen Verhältnisse der
Glykane zu erhalten. Die Methode wurde für den Einsatz in der pharmazeutischen Industrie
validiert. Die Daten zur Reproduzierbarkeit der Methode zeigten nur unwesentliche Abweichungen
zwischen unterschiedlichen Operatoren in verschiedenen Labors. Außerdem zeigte sich, dass die
Daten dieser Analysemethode mit den Ergebnissen einer orthogonlen Analysemethode, nämlich der
RPC-Analyse der (Glyko-)Peptide, übereinstimmen, was die Korrektheit der Quantifizierung
bestätigt.
Schließlich werden in der vierten Publikation die Eigenschaften von RPC, HILIC und PGCChromatographie
in Hinblick auf die Trennung von fluoreszenz-gelabelten Glykanen verglichen.
Hierfür wurde ein breites Set von high-mannose und complex Glykanen auf diesen stationären
Phasen chromatographiert und die generierten Retentionsdaten verglichen. Weiters wurden die
Retentionszeiten mittels multipler linearer Regression (MLR) mit der
Monosaccharidzusammensetzung korreliert. Im Gegensatz zu RPC und HILIC konnte für PGCChromatographie
kein adäquates Modell gefunden werden, was dafür spricht, dass die
Retentionszeiten von Glykanen auf PGC nicht allein durch deren Zusammensetzung determiniert
sind.
Abstract (eng)
Biopharmaceuticals are nowadays indispensable tools of the modern medicine. The production of
basic biomolecules (e.g. insulin) counts as routine, but the expression of complex proteins is still a
major challenge for biotechnology and the biopharmaceutical industry. Often post-translational
modifications are a prerequisite for the proper function of the product.
Glycosylation is one of the most common post-translational modifications in eukaryotic cells.
Several glycoproteins are being used as biopharmaceuticals, e.g. erythropoietin, interferons,
fibrinogen and a number of monoclonal antibodies. The impact of the glycosylation on efficacy and
safety is well documented in the literature.
Since the glycosylation of proteins is not driven by a template, but the result of the activities of
many enzymes it typically exhibits a very heterogenic pattern. The individual glycan structures and
their quantitative ratios are important parameters, which have to be determined to demonstrate the
consistency of the production process, as well as the safety and efficacy of the final product.
Several methods are employed for the analysis of protein glycosylation. High-performance liquid
chromatography (HPLC) of fluorescence labeled glycans serves as a reference method due to the
straight-forward quantitation utilizing the fluorescence signal. Typically reversed-phase
chromatography (RPC), hydrophilic-interaction chromatography (HILIC) or porous graphitic
carbon (PGC) chromatography are applied for the separation of glycans. This thesis focuses on
PGC.
Hence two publications investigate the retention mechanism of oligosaccharides on PGC. The
experiments revealed that the nature of the organic solvent in the mobile phase significantly impacts
the retention mechanism. Particularly acetonitrile offers unique properties for the separation of
glycans on PGC. The column temperature was identified as important parameter for the selectivity.
Furthermore the effect of oxidizing and reducing agents on the retention of neutral glycans were
demonstrated. Oxidation of PGC impeded the elution of an acidic glycan, which indicates that the
stationary phase was polarized. The phenomena generated by oxidation and reduction of PGC are
thoroughly discussed in the second publication.
A further publication describes the development and evaluation of an analysis method for
monoclonal antibody (mAb) glycans. The glycans were released from the protein by enzymatic
means and subsequently labeled with a fluorescence dye. The glycans were separated on a HILIC
- 90 -
column and quantified by the fluorescence signal. The sample preparation procedure was optimized
in respect to maintaining the original glycan pattern. The final analysis method was validated for the
use in the biopharmaceutical industry. Reproducibility data exhibited only marginal differences
between the results reported by different technicians from several laboratories. Furthermore the data
were affirmed by an orthogonal method, namely RPC analysis of (glyco-)peptides (peptide
mapping) with MS detection.
In a fourth publication the retention properties of RPC, HILIC and PGC in respect to fluorescence
labeled glycans are compared. The retention times of a set of glycans covering high-mannose and
complex type glycans were determined in all chromatography modes and subsequently compared.
Furthermore the retention times were correlated to the respective monosaccharide composition by
multiple linear regression (MLR). In contrast to RPC and HILIC no adequate model could be found
for PGC, which indicates that retention of oligosaccharides in PGC chromatography is not
determined by the monosaccharide composition.
Keywords (eng)
N-glycanschromatographymass spectrometry
Keywords (deu)
N-GlykaneChromatographieMassenspektrometrie
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1267524
rdau:P60550 (deu)
100 S. : graph. Darst.
Number of pages
100
Association (deu)
Title (eng)
Investigation of high-performance liquid chromatography methods for the analysis of protein N-glycans
Parallel title (deu)
Untersuchung von Hochleistungs-Flüssigchromatographie-Methoden zur Analyse von Protein N-Glykanen
Author
Michael Melmer
Abstract (deu)
Biopharmazeutika sind aus einigen Bereichen der modernen Medizin kaum noch wegzudenken.
Während die Herstellung vergleichsweise einfacher Biomoleküle, wie z.B. des Peptids Insulin,
mittlerweile Routine ist, stellt die Expression komplexer Proteine immer noch eine große
Herausforderung für die Biotechnologie bzw. die biopharmazeutische Industrie dar. Oft sind posttranslationale
Modifikationen der Proteine erforderlich, damit diese eine entsprechende Wirkung
zeigen.
Glykosylierung ist eine der häufigsten post-translationalen Modifikationen in eukaryotischen
Zellen. Deshalb ist es nicht überraschend, dass auch Glykoproteine als Biopharmazeutika
Anwendung finden, wie z.B. Erythropoietin, Interferone, Fibrinogen, sowie eine Reihe von
monoklonalen Antikörpern. Dass die Glykosylierung Einfluss auf die Wirksamkeit und auch die
Verträglichkeit hat, ist gut dokumentiert.
Da die Glykosylierung von Proteinen im Gegensatz zur Protein- und zur Nukleinsäurebiosynthese
nicht nach einer Vorlage erfolgt, sondern durch das Zusammenspiel einer Vielzahl an Enzymen
zustande kommt, weist sie in der Regel eine recht heterogene Zusammensetzung auf. Die
vorkommenden Glykane, sowie deren Verhältnisse sind wichtige Parameter, die analysiert werden
müssen um die Stabilität des Herstellprozesses, sowie die Sicherheit und Wirksamkeit des Produkts
sicherzustellen.
Für die Analyse der Glykosylierung kommen eine Reihe von Analysemethoden zur Anwendung,
wobei die Analyse von freien, mit Fluoreszenzfarbstoff gelabeleten Glykanen mittels
Hochleistungs-Flüssigchromatographie (high-performance liquid chromatography, HPLC) als
Referenzmethode gilt. Als stationäre Phasen stehen Umkehrphasen (reversed phase
chromatography, RPC), hydrophile Wechselwirkungsphasen (hydrophilic interaction
chromatography, HILIC) und poröser, graphitähnlicher Kohlenstoff (porous graphitic carbon,
PGC) zur Verfügung. Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag auf der letztgenannten Option.
Zwei Publikationen befassen sich mit dem Retentionsmechanismus von Oligosacchariden auf PGC.
Die Untersuchungen zeigen, dass das organische Lösungsmittel in der mobilen Phase den
Wechselwirkungsmechanismusstark beeinflusst. Besondere Eigenschaften weist vor allem
Acetonitril auf. Weiters wurde der Einfluss der Temperatur des Säulenofens als wichtiger Parameter
für die Selektivität identifiziert. Schließlich wird der Effekt von Oxidations- und Reduktionsmitteln
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auf die Retention von neutralen Glykanen gezeigt. Die Oxidation von PGC verhinderte außerdem
die Elution eines sauren Glykans vollständig, was für eine Polarisation der Oberfläche durch das
Reagens spricht. Die Auswirkungen der Reduktions- und Oxidationsmittel wird in der zweiten
Publikation ausführlich diskutiert.
Eine weitere Publikation beschäftigt sich mit der Etablierung einer vollständigen Analysemethode
für Glykane von therapeutischen Antikörpern. Die Glykane werden enzymatisch abgespalten, mit
einem Fluoreszenzfarbstoff gelabelts, mittels HILIC getrennt und durch Fluoreszenzdetektion
quantifiziert. Besondere Aufmerksamkeit lag auf der Probenvorbereitung, die mehrere Schritte
umfasst und dahingehend optimiert wurde die Integrität der ursprünglichen Verhältnisse der
Glykane zu erhalten. Die Methode wurde für den Einsatz in der pharmazeutischen Industrie
validiert. Die Daten zur Reproduzierbarkeit der Methode zeigten nur unwesentliche Abweichungen
zwischen unterschiedlichen Operatoren in verschiedenen Labors. Außerdem zeigte sich, dass die
Daten dieser Analysemethode mit den Ergebnissen einer orthogonlen Analysemethode, nämlich der
RPC-Analyse der (Glyko-)Peptide, übereinstimmen, was die Korrektheit der Quantifizierung
bestätigt.
Schließlich werden in der vierten Publikation die Eigenschaften von RPC, HILIC und PGCChromatographie
in Hinblick auf die Trennung von fluoreszenz-gelabelten Glykanen verglichen.
Hierfür wurde ein breites Set von high-mannose und complex Glykanen auf diesen stationären
Phasen chromatographiert und die generierten Retentionsdaten verglichen. Weiters wurden die
Retentionszeiten mittels multipler linearer Regression (MLR) mit der
Monosaccharidzusammensetzung korreliert. Im Gegensatz zu RPC und HILIC konnte für PGCChromatographie
kein adäquates Modell gefunden werden, was dafür spricht, dass die
Retentionszeiten von Glykanen auf PGC nicht allein durch deren Zusammensetzung determiniert
sind.
Abstract (eng)
Biopharmaceuticals are nowadays indispensable tools of the modern medicine. The production of
basic biomolecules (e.g. insulin) counts as routine, but the expression of complex proteins is still a
major challenge for biotechnology and the biopharmaceutical industry. Often post-translational
modifications are a prerequisite for the proper function of the product.
Glycosylation is one of the most common post-translational modifications in eukaryotic cells.
Several glycoproteins are being used as biopharmaceuticals, e.g. erythropoietin, interferons,
fibrinogen and a number of monoclonal antibodies. The impact of the glycosylation on efficacy and
safety is well documented in the literature.
Since the glycosylation of proteins is not driven by a template, but the result of the activities of
many enzymes it typically exhibits a very heterogenic pattern. The individual glycan structures and
their quantitative ratios are important parameters, which have to be determined to demonstrate the
consistency of the production process, as well as the safety and efficacy of the final product.
Several methods are employed for the analysis of protein glycosylation. High-performance liquid
chromatography (HPLC) of fluorescence labeled glycans serves as a reference method due to the
straight-forward quantitation utilizing the fluorescence signal. Typically reversed-phase
chromatography (RPC), hydrophilic-interaction chromatography (HILIC) or porous graphitic
carbon (PGC) chromatography are applied for the separation of glycans. This thesis focuses on
PGC.
Hence two publications investigate the retention mechanism of oligosaccharides on PGC. The
experiments revealed that the nature of the organic solvent in the mobile phase significantly impacts
the retention mechanism. Particularly acetonitrile offers unique properties for the separation of
glycans on PGC. The column temperature was identified as important parameter for the selectivity.
Furthermore the effect of oxidizing and reducing agents on the retention of neutral glycans were
demonstrated. Oxidation of PGC impeded the elution of an acidic glycan, which indicates that the
stationary phase was polarized. The phenomena generated by oxidation and reduction of PGC are
thoroughly discussed in the second publication.
A further publication describes the development and evaluation of an analysis method for
monoclonal antibody (mAb) glycans. The glycans were released from the protein by enzymatic
means and subsequently labeled with a fluorescence dye. The glycans were separated on a HILIC
- 90 -
column and quantified by the fluorescence signal. The sample preparation procedure was optimized
in respect to maintaining the original glycan pattern. The final analysis method was validated for the
use in the biopharmaceutical industry. Reproducibility data exhibited only marginal differences
between the results reported by different technicians from several laboratories. Furthermore the data
were affirmed by an orthogonal method, namely RPC analysis of (glyco-)peptides (peptide
mapping) with MS detection.
In a fourth publication the retention properties of RPC, HILIC and PGC in respect to fluorescence
labeled glycans are compared. The retention times of a set of glycans covering high-mannose and
complex type glycans were determined in all chromatography modes and subsequently compared.
Furthermore the retention times were correlated to the respective monosaccharide composition by
multiple linear regression (MLR). In contrast to RPC and HILIC no adequate model could be found
for PGC, which indicates that retention of oligosaccharides in PGC chromatography is not
determined by the monosaccharide composition.
Keywords (eng)
N-glycanschromatographymass spectrometry
Keywords (deu)
N-GlykaneChromatographieMassenspektrometrie
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
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