Title (eng)
Allergen-induced regulatory properties of the CD4+CD25+ subset in cord blood and possible implications on the post-natal tolerance induction
Parallel title (deu)
Allergen-induzierte regulatorische Eigenschaften der CD4+CD25+ Population in Nabelschnurblut und mögliche Implikationen auf die post-natale Toleranzentstehung
Author
Elisabeth Mayer
Advisor
Ibrahim Elmadfa
Assessor
Lajos Rethy
Martina Prelog
Abstract (deu)
Hintergrund: Nabelschnurblut T Zellen proliferieren trotz ihres naïven Phänotyps auf unterschiedlichste Allergene. Diese erhöhte Immunantwort kann nicht vollends erklärt werden. Sie könnte einerseits auf eine funktionelle Unreife der regulatorischen T Zellen (Tregs) im Nabelschnurblut als auch auf Endotoxinkontaminationen in Allergenpräparaten zurückgeführt werden. Funktionelle Unterschiede im T regulatorischen Kompartment von Nabelschnurblut und Erwachsenenblut und deren mögliche Relevanz für die Entstehung allergen-spezifischer Toleranz werden jedoch noch ungenügend verstanden.
Ziel: Ziel ist es die Eigenheiten allergen-spezifischer Immunantworten von Nabelschnurblutzellen in vitro zu definieren. Spezieller Fokus wird dabei auf regulatorische T Zellen und auf den Einfluss von Endotoxinkontaminationen gelegt.
Methoden: Der Endotoxingehalt unterschiedlicher Allergenpräparationen wurde mittels Limulus assay bestimmt. Der Einfluss von Endotoxinkontaminationen auf die Proliferations- und Zytokinantwort mononukleärer Zellen wurde mit [3H]Thymidin-assay und ELISA bestimmt. Mittels „Size Exclusion Chromatography“ wurde der relative Anteil gereinigter Proteine im Vergleich zu Endotoxinkontaminationen im Bezug auf die proliferative Kapazität getestet. Die Abhängigkeit der Toll-like Rezeptoren (TLR2 und 4) der Kontaminationsprodukte wurde mittels Blockierungsversuchen und TLR-transfizierter HEK-Zellen ausgetestet. T regulatorische Zellen wurden durch RT-PCR und FACS charakterisiert. Sub-Populationen wurden mit Hilfe von MACS und FACS aufgereinigt und deren suppressives Potential in vitro durch Inhibitionsassays ([3H]-Thymidineinbau und CFSE Färbung) bestimmt.
Ergebnisse: Allergen- als auch Endotoxin induzierte Immunantworten im Nabelschnurblut sind im Vergleich zum Erwachsenenblut erhöht. Im Gegensatz zu den CD4+CD25high T Zellen im Erwachsenenblut zeigten die Nabelschnurblut T regulatorischen Zellen eine stark verminderte suppressive Kapazität. Dieser Effekt konnte weder mit einer geringeren Frequenz der FoxP3+CD4+CD25high noch durch differentielle Expression der Treg Marker GARP, CD127, oder den Treg-assoziierten Transkriptionsfaktoren RUNX 1, RUNX 3 und FoxP3 erklärt werden. Lediglich eine Untergruppe der regulatorischen T Zellen (CD4+CD25highCD127low und CD4+CD25intCD127low) besaß inhibitorisches Potenzial. In vitro Exposition von Allergenen führt jedoch zu einer funktionellen Aktivierung regulatorischer T Zellen im Nabelschnurblut. Es kommt dabei einerseits zu einer Aktivierung und andererseits zu einer Proliferation der CD4+CD25high T Zellen, die in beiden Fällen allergen-spezifische suppressive Kapazität besitzen.
Schlussfolgerung: Endotoxine in Allergenpräparaten wirken als systematische Störvariabel in in vitro Versuchen. Der Einfluss dieser Kontamination hängt stark von der Blutquelle (Nabelschnur- vs. Erwachsenenblut), dem Allergen, der Endotoxinmenge und der daraus resultierende Kinetik ab. Nabelschnurblut besitzt abgesehen von einer Subgruppe regulatorischer T Zellen mit inhibitorischer Kapazität eine regulatorische Population die funktionell unreif ist. Im Falle einer Allergen-Exposition wird diese CD4+CD25high Treg Population funktionell, somit suppressiv und beginnt zu expandieren.
Abstract (eng)
Background: Upon antigen exposure cord blood derived T cells respond to ubiquitous environmental antigens by proliferation. To date it remains unclear whether these “heightened” responses relate to different regulatory properties of the regulatory T cell (Treg) compartment or whether this can be explained due to endotoxin contamination detected in allergen preparations. Distinct effects of endotoxin on cells in cord and adult blood are poorly defined.
Objectives: To examine the specific nature of allergen-specific responses of cord blood derived T-cell in vitro in detail with special focus on regulatory T cells and determine the impact endotoxin contaminaiton in allergen preparations in this context.
Methods: The endotoxin content was assessed via limulus assay. Proliferative and cytokine response of mononuclear cells were evaluated via ([3H]thymidine incorporation and ELISA. Size exclusion chromatography of endotoxin contaminated BLG was performed to define the impact of the protein on the proliferative responses measured. The involvement of toll like receptor 2 and 4 was investigated by blocking antibodies and toll like receptor-transfected HEK cells. The Treg compartment in cord blood and peripheral blood was characterized via flow cytometry using MACS and FACS sorting. The suppressive potential per se and upon in vitro priming was evaluated via functional inhibition assays ([3H]thymidine incorporation assay and CFSE staining). Suppressive properties of expanding cell populations were investigated using FACS sorting.
Results: Allergen- and endotoxin-induced proliferative responses in cord blood were significantly enhanced compared to those in adult blood. Compared to un-primed CD4+CD25high cells from adult blood, the respective cord blood derived population did not show inhibitory capacities upon TCR activation. This could not be explained by a significantly lower frequency of FoxP3+CD4+CD25high cells or different expression of the Treg markers GARP, CD127, or the Treg associated transcription factors RUNX 1, RUNX 3 and FOXP3. FACS sorting experiments of unstimulated cells revealed subsets in cord blood (CD4+CD25highCD127low and CD4+CD25intCD127low) that possessed inhibitory potential. In vitro exposure to allergens leads to both functional activation of both an expanding and a resting Treg population.
Conclusion: Endotoxins in allergen preparations act as confounder in the assessment of allergen-specific responses. The impact of these contaminations is strongly related to the blood source (cord vs peripheral blood), the type of allergen, the amount of endotoxin and the thereof resulting kinetics and regulatory properties. Cord blood harbours a very small subset of Tregs that is not able to exert net inhibitory effects within the mononuclear cell fraction. However in case of antigen-exposure the putative Treg subset (CD4+CD25high) becomes highly suppressive and expands.
Keywords (eng)
β-lactoglobulincord bloodendotoxin contaminationfood allergensregulatory T cellsT-cellstoll like receptors
Keywords (deu)
β-LactoglobulinNabelschnurblutEndotoxinKontaminationNahrungsmittelallergeneRegulatorische T ZellenToll-like Rezeptoren
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
Extent (deu)
X, 161 S.
Number of pages
173
Association (deu)
Title (eng)
Allergen-induced regulatory properties of the CD4+CD25+ subset in cord blood and possible implications on the post-natal tolerance induction
Parallel title (deu)
Allergen-induzierte regulatorische Eigenschaften der CD4+CD25+ Population in Nabelschnurblut und mögliche Implikationen auf die post-natale Toleranzentstehung
Author
Elisabeth Mayer
Abstract (deu)
Hintergrund: Nabelschnurblut T Zellen proliferieren trotz ihres naïven Phänotyps auf unterschiedlichste Allergene. Diese erhöhte Immunantwort kann nicht vollends erklärt werden. Sie könnte einerseits auf eine funktionelle Unreife der regulatorischen T Zellen (Tregs) im Nabelschnurblut als auch auf Endotoxinkontaminationen in Allergenpräparaten zurückgeführt werden. Funktionelle Unterschiede im T regulatorischen Kompartment von Nabelschnurblut und Erwachsenenblut und deren mögliche Relevanz für die Entstehung allergen-spezifischer Toleranz werden jedoch noch ungenügend verstanden.
Ziel: Ziel ist es die Eigenheiten allergen-spezifischer Immunantworten von Nabelschnurblutzellen in vitro zu definieren. Spezieller Fokus wird dabei auf regulatorische T Zellen und auf den Einfluss von Endotoxinkontaminationen gelegt.
Methoden: Der Endotoxingehalt unterschiedlicher Allergenpräparationen wurde mittels Limulus assay bestimmt. Der Einfluss von Endotoxinkontaminationen auf die Proliferations- und Zytokinantwort mononukleärer Zellen wurde mit [3H]Thymidin-assay und ELISA bestimmt. Mittels „Size Exclusion Chromatography“ wurde der relative Anteil gereinigter Proteine im Vergleich zu Endotoxinkontaminationen im Bezug auf die proliferative Kapazität getestet. Die Abhängigkeit der Toll-like Rezeptoren (TLR2 und 4) der Kontaminationsprodukte wurde mittels Blockierungsversuchen und TLR-transfizierter HEK-Zellen ausgetestet. T regulatorische Zellen wurden durch RT-PCR und FACS charakterisiert. Sub-Populationen wurden mit Hilfe von MACS und FACS aufgereinigt und deren suppressives Potential in vitro durch Inhibitionsassays ([3H]-Thymidineinbau und CFSE Färbung) bestimmt.
Ergebnisse: Allergen- als auch Endotoxin induzierte Immunantworten im Nabelschnurblut sind im Vergleich zum Erwachsenenblut erhöht. Im Gegensatz zu den CD4+CD25high T Zellen im Erwachsenenblut zeigten die Nabelschnurblut T regulatorischen Zellen eine stark verminderte suppressive Kapazität. Dieser Effekt konnte weder mit einer geringeren Frequenz der FoxP3+CD4+CD25high noch durch differentielle Expression der Treg Marker GARP, CD127, oder den Treg-assoziierten Transkriptionsfaktoren RUNX 1, RUNX 3 und FoxP3 erklärt werden. Lediglich eine Untergruppe der regulatorischen T Zellen (CD4+CD25highCD127low und CD4+CD25intCD127low) besaß inhibitorisches Potenzial. In vitro Exposition von Allergenen führt jedoch zu einer funktionellen Aktivierung regulatorischer T Zellen im Nabelschnurblut. Es kommt dabei einerseits zu einer Aktivierung und andererseits zu einer Proliferation der CD4+CD25high T Zellen, die in beiden Fällen allergen-spezifische suppressive Kapazität besitzen.
Schlussfolgerung: Endotoxine in Allergenpräparaten wirken als systematische Störvariabel in in vitro Versuchen. Der Einfluss dieser Kontamination hängt stark von der Blutquelle (Nabelschnur- vs. Erwachsenenblut), dem Allergen, der Endotoxinmenge und der daraus resultierende Kinetik ab. Nabelschnurblut besitzt abgesehen von einer Subgruppe regulatorischer T Zellen mit inhibitorischer Kapazität eine regulatorische Population die funktionell unreif ist. Im Falle einer Allergen-Exposition wird diese CD4+CD25high Treg Population funktionell, somit suppressiv und beginnt zu expandieren.
Abstract (eng)
Background: Upon antigen exposure cord blood derived T cells respond to ubiquitous environmental antigens by proliferation. To date it remains unclear whether these “heightened” responses relate to different regulatory properties of the regulatory T cell (Treg) compartment or whether this can be explained due to endotoxin contamination detected in allergen preparations. Distinct effects of endotoxin on cells in cord and adult blood are poorly defined.
Objectives: To examine the specific nature of allergen-specific responses of cord blood derived T-cell in vitro in detail with special focus on regulatory T cells and determine the impact endotoxin contaminaiton in allergen preparations in this context.
Methods: The endotoxin content was assessed via limulus assay. Proliferative and cytokine response of mononuclear cells were evaluated via ([3H]thymidine incorporation and ELISA. Size exclusion chromatography of endotoxin contaminated BLG was performed to define the impact of the protein on the proliferative responses measured. The involvement of toll like receptor 2 and 4 was investigated by blocking antibodies and toll like receptor-transfected HEK cells. The Treg compartment in cord blood and peripheral blood was characterized via flow cytometry using MACS and FACS sorting. The suppressive potential per se and upon in vitro priming was evaluated via functional inhibition assays ([3H]thymidine incorporation assay and CFSE staining). Suppressive properties of expanding cell populations were investigated using FACS sorting.
Results: Allergen- and endotoxin-induced proliferative responses in cord blood were significantly enhanced compared to those in adult blood. Compared to un-primed CD4+CD25high cells from adult blood, the respective cord blood derived population did not show inhibitory capacities upon TCR activation. This could not be explained by a significantly lower frequency of FoxP3+CD4+CD25high cells or different expression of the Treg markers GARP, CD127, or the Treg associated transcription factors RUNX 1, RUNX 3 and FOXP3. FACS sorting experiments of unstimulated cells revealed subsets in cord blood (CD4+CD25highCD127low and CD4+CD25intCD127low) that possessed inhibitory potential. In vitro exposure to allergens leads to both functional activation of both an expanding and a resting Treg population.
Conclusion: Endotoxins in allergen preparations act as confounder in the assessment of allergen-specific responses. The impact of these contaminations is strongly related to the blood source (cord vs peripheral blood), the type of allergen, the amount of endotoxin and the thereof resulting kinetics and regulatory properties. Cord blood harbours a very small subset of Tregs that is not able to exert net inhibitory effects within the mononuclear cell fraction. However in case of antigen-exposure the putative Treg subset (CD4+CD25high) becomes highly suppressive and expands.
Keywords (eng)
β-lactoglobulincord bloodendotoxin contaminationfood allergensregulatory T cellsT-cellstoll like receptors
Keywords (deu)
β-LactoglobulinNabelschnurblutEndotoxinKontaminationNahrungsmittelallergeneRegulatorische T ZellenToll-like Rezeptoren
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
Number of pages
173
Association (deu)
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