Title (eng)
Intracellular modification of microglial membrane currents and their heterogeneity in different brain regions in acute mouse brain slices
Parallel title (deu)
Intrazelluläre Modifikation von Mikroglia Membranströmen und ihre Heterogenität in verschiedenen Gehirnarealen in akuten Maushirnschnitten
Author
Nathalie Chandra Kaufmann
Advisor
Helmut Kettenmann
Co-Advisor
Monika Bradl
Assessor
Helmut Kettenmann
Abstract (deu)
Obwohl Mikroglia in den letzten 10 Jahren elektophysiologisch charakterisiert wurden, bleiben viele Fragen offen. Das liegt auch daran, dass kultivierte Mikroglia und solche in akuten Hirn-schnitten verschiedene Eigenschaften aufweisen (Farber and Kettenmann, 2005). Es ist daher nicht sicher, ob alle in Zellkultur beschriebenen Rezeptoren und Ionenkanäle auch in Mikroglia in akuten Schnitten zu finden sind. Neben Kaliumkanälen, die Mikroglia elektrophysiologisch prägen, tragen andere Ionenkanäle wichtige Rollen (Kettenmann et al., 2011). Wie alle Ionenka-näle, können jene in Mikroglia Membranen durch G-proteine und sekundäre Botenstoffe funkti-onell reguliert werden. Da bei der whole-cell patch clamp Methode sowohl die intra- als auch die extrazelluläre Flüssigkeit genau definiert sind, sind gezielte Manipulationen möglich. Um den Effekt der funktionellen Ionenkanalregulation auf Mikroglia Membranströme zu bestimmen, wurde die intrazelluläre Lösung modifiziert. Dazu wurden eine höhere Natriumkonzentration, der beinahe universelle G-Protein Aktivator GTPγS sowie der allgegenwärtige sekundäre Boten-stoff cAMP der intrazellulären Lösung beigemengt. Da die Dialyse des Zellinneren mit der Intra-zellulären Lösung langsam voranschreitet, wurde ein sieben Minuten langes patch clamp Proto-koll erarbeitet. Nachdem Natrium eine Vielzahl von intrazellulären Zielen aufweist, wurde es benutzt um zu testen, ob Kaliumströme intrazellulär modifiziert werden können. Mikroglia rea-gierten mit einer signifikant höheren Stromdichte als Antwort auf negative Spannungsschritte (p<0.0001 bis p=0.0121). Weiters wiesen Mikroglia mit höherer intrazellulärer Natriumkon-zentration eine niedrigere Zellkapazität (p=0.0456) und niedrigeres Membranpotenzial (p=0.075) auf als Kontrollzellen. Im nächsten Schritt wurde die intrazelluläre Modulation von G-protein gekoppelten Rezeptoren mit dem beinahe universellen Gα Protein Aktivator GTPγS, so-wie dem sekundären Botenstoff cAMP getestet. Sowohl GTPγS als auch cAMP führten zu einer signifikanten Reduktion der Stromdichte (p<0.05). Bei einem Vergleich der auswärts Leitfähig-keit zwischen den beiden Messpunkten bei einer und nach sieben Minuten wurde diese jedoch nur von GTPγS signifikant reduziert (p=0.0002). Weiters führte GTPγS zu einer Änderung der ATP Antwort. Anstatt des üblichen Auswärtsstromes (Boucsein et al., 2000) bei Spannungen positiver als -60 mV, resultierte Zugabe von GTPγS in die Intrazelluläre Lösung in einem Ein-wärtsstrom. Aktuellen Beobachtungen zufolge sind Mikroglia durch funktionelle Heterogenität charakterisiert, die sich in verschiedenen Proteinexpressionsmustern wiederspiegeln könnte (Gertig and Hanisch, 2014). Es wurde spekuliert, dass dieser Heterogenität spezifische Anpas-sung auf lokal begrenzte Signalbotenstoffe zugrunde liegen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wur-den daher bereits charakterisierte Mikroglia im cerebralen Cortex mit Mikroglia im Cerebellum und Thalamus verglichen. Erstaunlicher Weise wiesen Mikroglia im Cerebellum eine signifikant höhere ein einwärts (p=0.007 und p<0.0001 verglichen mit Thalamus und Cortex) und auswärts (p=0.0297 und p=0.0007) Leitfähigkeit sowie eine niedrigere Zellkapazität (p=0.0002) als Zellen im Cortex auf. Während die kleinere Membranoberfläche von Mikroglia im Cerebellum bereits in histologischen Studien (Lawson et al., 1990; Vela et al., 1995) auffiel, ist die höhere Leitfähigkeit eine neue Observation. Diese Arbeit liefert daher neue Erkenntnisse über die Elektrophysiologie von Mikroglia. Insbesondere die intrazelluläre Modifikation von Membranströmen ist ein An-satz, dem in Mikroglia bisher nur wenig Beachtung geschenkt wurde. Die Charakterisierung von Mikroglia in verschiedenen Arealen zeigt, dass heterogene Mikrogliapopulationen bestehen. Besonders die unterliegenden Mechanismen dieser Heterogenität sollten in der Zukunft weiter analysiert werden.
Abstract (eng)
Although microglia have been electrophysiologically characterized over the past decade, many questions remain unresolved. This is at least in part due to the fact that microglia in culture seem to exhibit different properties than in acute slices (Farber and Kettenmann, 2005). It is therefore not clear if all channels and receptors described in culture can be found in microglia in acute slices. Apart from the pronounced potassium conductance in glial cells, other ion channels are important for nervous system homeostasis (Kettenmann et al., 2011). As all ion channels, microglial channels are prone to functional regulation by G-proteins and second-messenger pathways. Since the compositions of both the extra- and intracellular solution are predefined in whole-cell patch clamp experiments, specific modifications are possible. In order to test the ef-fect of functional ion channel regulation on microglial membrane currents, a high sodium con-centration, a near-universal G-protein activator and ubiquitous second messenger molecule were individually added to the intracellular solution during a seven minutes recording to ensure full dialysis. Since high intracellular sodium concentration is believed to act on a multitude of intracellular targets, it was used to test if potassium currents could be modified intracellularly. Interestingly, microglia responded with a significantly increased current density (p<0.0001 to p=0.0121) in response to negative voltage steps in response to high intracellular sodium when compared to standard intracellular solution. Additionally, cells treated with high intracellular sodium also exhibited a lower capacitance (p=0.0456) and membrane potential (p=0.075) than control cells. In a next step, intracellular modulation of G-protein coupled receptors was at-tempted with the nearly universal Gα protein activator GTPγS. Additionally, the ubiquitous in-tracellular second messenger molecule cAMP was applied intracellularly. While both GTPγS and cAMP significantly reduced the current density (p<0.05) when compared to the control, only GTPγS exhibited a reduction in outward conductance (p=0.0002) between the one and seven minute recordings. In contrast to cAMP, GTPγS also affected the microglial ATP response. In con-trast to the usually observed outward current (Boucsein et al., 2000) at voltages positve to -60 mV, intracellularly applied GTPγS induced an inward current, which was significantly different from control and cAMP ATP responses (p=0.003 to 0.0007). Furthermore, recent observations suggest that microglia exhibit functional and therefore expressional heterogeneity (Gertig and Hanisch, 2014). It has been speculated that this heterogeneity is based on adaptations to specific signaling molecule milieus. In the second part of this project, microglia were therefore compared between the well-characterized cerebral cortex and two novel areas, namely the cerebellum and thalamus. Surprisingly, inward (p=0.007 and p<0.0001 compared to thalamus and cortex, respectively) and outward (p=0.0297 and p=0.0007) membrane conductance was significantly increased in the cerebellum. Additionally, membrane capacitance of cerebellar microglia was found to be significantly decreased (p=0.0002). While the smaller membrane area of cerebellar microglia has already been noted in immunohistochemical studies (Lawson et al., 1990; Vela et al., 1995), the increased conductance is a novel oberservation. This current project therefore yields new insight into the electrophysiology of murine microglia. Especially the intracellular modification of membrane currents is a relatively new approach in microglia. Furthermore, the characterization of microglial membrane currents in different brain areas demonstrates that heterogeneous microglia populations do exist. The underlying mechanisms of this heterogeneity should be further investigated.
Keywords (eng)
microgliapatch clampintracellular modificationGTPgammaScAMPcerebellumthalamus
Keywords (deu)
MikrogliaPatch clampintrazelluläre ModifikationGTPgammaScAMPCerebellumThalamus
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1321346
rdau:P60550 (deu)
44 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Number of pages
44
Association (deu)
Title (eng)
Intracellular modification of microglial membrane currents and their heterogeneity in different brain regions in acute mouse brain slices
Parallel title (deu)
Intrazelluläre Modifikation von Mikroglia Membranströmen und ihre Heterogenität in verschiedenen Gehirnarealen in akuten Maushirnschnitten
Author
Nathalie Chandra Kaufmann
Abstract (deu)
Obwohl Mikroglia in den letzten 10 Jahren elektophysiologisch charakterisiert wurden, bleiben viele Fragen offen. Das liegt auch daran, dass kultivierte Mikroglia und solche in akuten Hirn-schnitten verschiedene Eigenschaften aufweisen (Farber and Kettenmann, 2005). Es ist daher nicht sicher, ob alle in Zellkultur beschriebenen Rezeptoren und Ionenkanäle auch in Mikroglia in akuten Schnitten zu finden sind. Neben Kaliumkanälen, die Mikroglia elektrophysiologisch prägen, tragen andere Ionenkanäle wichtige Rollen (Kettenmann et al., 2011). Wie alle Ionenka-näle, können jene in Mikroglia Membranen durch G-proteine und sekundäre Botenstoffe funkti-onell reguliert werden. Da bei der whole-cell patch clamp Methode sowohl die intra- als auch die extrazelluläre Flüssigkeit genau definiert sind, sind gezielte Manipulationen möglich. Um den Effekt der funktionellen Ionenkanalregulation auf Mikroglia Membranströme zu bestimmen, wurde die intrazelluläre Lösung modifiziert. Dazu wurden eine höhere Natriumkonzentration, der beinahe universelle G-Protein Aktivator GTPγS sowie der allgegenwärtige sekundäre Boten-stoff cAMP der intrazellulären Lösung beigemengt. Da die Dialyse des Zellinneren mit der Intra-zellulären Lösung langsam voranschreitet, wurde ein sieben Minuten langes patch clamp Proto-koll erarbeitet. Nachdem Natrium eine Vielzahl von intrazellulären Zielen aufweist, wurde es benutzt um zu testen, ob Kaliumströme intrazellulär modifiziert werden können. Mikroglia rea-gierten mit einer signifikant höheren Stromdichte als Antwort auf negative Spannungsschritte (p<0.0001 bis p=0.0121). Weiters wiesen Mikroglia mit höherer intrazellulärer Natriumkon-zentration eine niedrigere Zellkapazität (p=0.0456) und niedrigeres Membranpotenzial (p=0.075) auf als Kontrollzellen. Im nächsten Schritt wurde die intrazelluläre Modulation von G-protein gekoppelten Rezeptoren mit dem beinahe universellen Gα Protein Aktivator GTPγS, so-wie dem sekundären Botenstoff cAMP getestet. Sowohl GTPγS als auch cAMP führten zu einer signifikanten Reduktion der Stromdichte (p<0.05). Bei einem Vergleich der auswärts Leitfähig-keit zwischen den beiden Messpunkten bei einer und nach sieben Minuten wurde diese jedoch nur von GTPγS signifikant reduziert (p=0.0002). Weiters führte GTPγS zu einer Änderung der ATP Antwort. Anstatt des üblichen Auswärtsstromes (Boucsein et al., 2000) bei Spannungen positiver als -60 mV, resultierte Zugabe von GTPγS in die Intrazelluläre Lösung in einem Ein-wärtsstrom. Aktuellen Beobachtungen zufolge sind Mikroglia durch funktionelle Heterogenität charakterisiert, die sich in verschiedenen Proteinexpressionsmustern wiederspiegeln könnte (Gertig and Hanisch, 2014). Es wurde spekuliert, dass dieser Heterogenität spezifische Anpas-sung auf lokal begrenzte Signalbotenstoffe zugrunde liegen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wur-den daher bereits charakterisierte Mikroglia im cerebralen Cortex mit Mikroglia im Cerebellum und Thalamus verglichen. Erstaunlicher Weise wiesen Mikroglia im Cerebellum eine signifikant höhere ein einwärts (p=0.007 und p<0.0001 verglichen mit Thalamus und Cortex) und auswärts (p=0.0297 und p=0.0007) Leitfähigkeit sowie eine niedrigere Zellkapazität (p=0.0002) als Zellen im Cortex auf. Während die kleinere Membranoberfläche von Mikroglia im Cerebellum bereits in histologischen Studien (Lawson et al., 1990; Vela et al., 1995) auffiel, ist die höhere Leitfähigkeit eine neue Observation. Diese Arbeit liefert daher neue Erkenntnisse über die Elektrophysiologie von Mikroglia. Insbesondere die intrazelluläre Modifikation von Membranströmen ist ein An-satz, dem in Mikroglia bisher nur wenig Beachtung geschenkt wurde. Die Charakterisierung von Mikroglia in verschiedenen Arealen zeigt, dass heterogene Mikrogliapopulationen bestehen. Besonders die unterliegenden Mechanismen dieser Heterogenität sollten in der Zukunft weiter analysiert werden.
Abstract (eng)
Although microglia have been electrophysiologically characterized over the past decade, many questions remain unresolved. This is at least in part due to the fact that microglia in culture seem to exhibit different properties than in acute slices (Farber and Kettenmann, 2005). It is therefore not clear if all channels and receptors described in culture can be found in microglia in acute slices. Apart from the pronounced potassium conductance in glial cells, other ion channels are important for nervous system homeostasis (Kettenmann et al., 2011). As all ion channels, microglial channels are prone to functional regulation by G-proteins and second-messenger pathways. Since the compositions of both the extra- and intracellular solution are predefined in whole-cell patch clamp experiments, specific modifications are possible. In order to test the ef-fect of functional ion channel regulation on microglial membrane currents, a high sodium con-centration, a near-universal G-protein activator and ubiquitous second messenger molecule were individually added to the intracellular solution during a seven minutes recording to ensure full dialysis. Since high intracellular sodium concentration is believed to act on a multitude of intracellular targets, it was used to test if potassium currents could be modified intracellularly. Interestingly, microglia responded with a significantly increased current density (p<0.0001 to p=0.0121) in response to negative voltage steps in response to high intracellular sodium when compared to standard intracellular solution. Additionally, cells treated with high intracellular sodium also exhibited a lower capacitance (p=0.0456) and membrane potential (p=0.075) than control cells. In a next step, intracellular modulation of G-protein coupled receptors was at-tempted with the nearly universal Gα protein activator GTPγS. Additionally, the ubiquitous in-tracellular second messenger molecule cAMP was applied intracellularly. While both GTPγS and cAMP significantly reduced the current density (p<0.05) when compared to the control, only GTPγS exhibited a reduction in outward conductance (p=0.0002) between the one and seven minute recordings. In contrast to cAMP, GTPγS also affected the microglial ATP response. In con-trast to the usually observed outward current (Boucsein et al., 2000) at voltages positve to -60 mV, intracellularly applied GTPγS induced an inward current, which was significantly different from control and cAMP ATP responses (p=0.003 to 0.0007). Furthermore, recent observations suggest that microglia exhibit functional and therefore expressional heterogeneity (Gertig and Hanisch, 2014). It has been speculated that this heterogeneity is based on adaptations to specific signaling molecule milieus. In the second part of this project, microglia were therefore compared between the well-characterized cerebral cortex and two novel areas, namely the cerebellum and thalamus. Surprisingly, inward (p=0.007 and p<0.0001 compared to thalamus and cortex, respectively) and outward (p=0.0297 and p=0.0007) membrane conductance was significantly increased in the cerebellum. Additionally, membrane capacitance of cerebellar microglia was found to be significantly decreased (p=0.0002). While the smaller membrane area of cerebellar microglia has already been noted in immunohistochemical studies (Lawson et al., 1990; Vela et al., 1995), the increased conductance is a novel oberservation. This current project therefore yields new insight into the electrophysiology of murine microglia. Especially the intracellular modification of membrane currents is a relatively new approach in microglia. Furthermore, the characterization of microglial membrane currents in different brain areas demonstrates that heterogeneous microglia populations do exist. The underlying mechanisms of this heterogeneity should be further investigated.
Keywords (eng)
microgliapatch clampintracellular modificationGTPgammaScAMPcerebellumthalamus
Keywords (deu)
MikrogliaPatch clampintrazelluläre ModifikationGTPgammaScAMPCerebellumThalamus
Subject (deu)
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