Aufgrund des weltweit steigenden Konsums von tierischen Proteins, ist die intensive Landwirtschaft darauf angehalten, den Einsatz von Antibiotika dementsprechend zu erhöhen. (Boland et al., 2013; Van Boeckel et al., 2015) Das größte Risiko des übermäßigen Einsatzes von Antibiotika in der Tierzucht, ist die Entwicklung von resistenten Bakteriensträngen, welche direkt über tierische Lebensmittel in den Menschen aufgenommen werden und somit eine mögliche Antibiotikaresistenz auslösen können. (Newell et al., 2010; Phillips et al., 2004)
Um die Konsumenten vor dieser Exposition zu schützen, wurden von der Europäischen Union im Rahmen der Verordung EU (VO) 37/2010 maximal zulässige Höchstwerte von pharmakologisch wirksamen Substanzen in tierischen Rohstoffen festgelegt. (The European Commission, 2010)
Basierend auf dieser Verordnung war das Ziel dieser Arbeit eine UHPLC-MS/MS Methode für die quantitative Bestimmung von 30 Analyten diverser Wirkstoffklassen (Quinolone, Makrolide, Lincosamide, ß-Laktame, Sulfonamide, Diaminopyrimidin-Derivate und Tetrazykline) zu entwickeln und anschließend zu validieren. Da die entwickelte Methode als akkreditierte Routineuntersuchungsmethode in der Firma LVA GmbH angeboten werden soll, wurde ein breites Spektrum an Matrizen (10 Milchprodukte, 10 Fleisch- und Fischprodukte) für die Validierung ausgewählt.
Zur Entwicklung der Methode wurden verschiedene Ansätze zur Probenaufabeitung (Dilute-and-Shoot, QuEChERS and SPE) mit Milchproben biologischer Qualität, welche mit einem Antibiotika-Mix auf eine Konzentration von 1/10 der MRLs dotiert wurden, durchgeführt.
Wie aus den Ergebnissen ersichtlich, konnten zufriedenstellende Wiederfindungsraten (70–120%) mittels der Kombination von ACN und McIlvaine-Puffer zur Proteinfällung und der anschließenden Aufreinung mit C18EC bulk Material erzielt werden. Die Quantifizierung erfolgt für ausgewählte Substanzen über den Zusatz eines internen Standards, um sowohl Matrixeffekte, als auch möglichen Analytenverlust während des Aufarbeitungsprozesses zu kompensieren.
Diese Methode wurde gemäß der in-House Validierungs Richtlinien validiert, wobei Wiederfindungsraten (%), Standardabweichung (%), Nachweis- (LOD) und Bestimmungsgrenze (LOQ) der Methode in allen Matrizen ermittelt wurde. Zur Überprüfung der Richtigkeit der Methode wurde erfolgreich (z-score < ± 2.00) an verschiedenen Ringversuchen des Anbieters Test Veritas S.r.l. teilgenommen. (Table 18)
Abschließend wurde die neu entwickelte und validierte Methode zur Überprüfung an das Akkreditierungsservice „Akkreditierung Austria“ eingereicht und erhielt nach erfolgreichem Audit den Status einer akkreditierten Methode nach ISO 17025:9001.

In line with the worldwide increasing demand of animal protein for the human consumption, the intensive livestock production requires an increasing amount of veterinary drugs. (Boland et al., 2013; Van Boeckel et al., 2015) The main risk of the severe overuse of antibiotics is a worldwide development of antibiotic resistance. Resistant bacterial strains may be present in food producing animals and can thereby directly be transmitted via food chain to the human. (Newell et al., 2010; Phillips et al., 2004)
To protect the customers from the uptake of antimicrobial substances by animal derived food stuff, the European Union set maximum residue levels (MRLs) in the Council Regulation 37/2010. (The European Commission, 2010)
In accordance to these MRLs this work aimed to develop a confirmatory UHPLC-MS/MS routine method to quantify 30 antibiotic substances belonging to the compound groups of quinolones, macrolides, lincosamides, ß-lactams, sulphonamides, diaminopyrimidine-derivate and tetracyclines. Since the finalized method will be offered as an accredited routine test method for the company LVA GmbH, a wide range of different kind of matrices were chosen (ten dairy matrices and ten different fish and meat matrices) for validation.
During method development phase different sample preparation approaches were investigated (Dilute-and-Shoot, QuEChERS and SPE) by using organic bovine milk samples fortified with an antibiotic-mix resulting in a concentration of 1/10 of their MRLs.
Results are demonstrating that satisfying recovery rates (70–120%) were only obtained by using C18EC bulk sorbent for sample clean-up after extraction with ACN in combination with McIlvaine buffer. Quantification of chosen substances were performed by using internal standards to correct matrix interferences as well as losses during sample preparation procedure.
The final developed method was validated in accordance to our in-house validation scheme, assessing recovery rates (%), RSD (%), limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) for all substances in each matrix, listed in appendix III. To proof the accuracy of the method, we successfully (z-score < ± 2.00) participated on different proficiency tests, provided by Test Veritas S.r.I. (Table 18)
Finally, the method was reviewed from the accreditation service “Akkreditierung Austria” and received the status of an accredited method in accordance to ISO 17025:9001.