Title (deu)
Automatisierte Herstellung rekombinanter Mutanten für die biophysikalische Charakterisierung allosterischer Modulierung in DC-SIGN
Parallel title (eng)
Automated production of recombinant mutants for biophysical characterization of allosteric modulation in DC-SIGN
Author
Gregor Suchy
Advisor
Christoph Rademacher
Assessor
Christoph Rademacher
Abstract (deu)
DC-SIGN ist ein Protein aus der Familie der C-Typ Lektine und besitzt eine charakteristische Kohlenhydraterkennungsdomäne, die eine Ca2+ abhängige Bindung von Kohlenhydraten ermöglicht. DC-SIGN reguliert unter anderem Dendritischen Zellen und beeinflusst deren Migration und Adhäsion. Außerdem spielt es eine wichtige Rolle bei Entzündungsreaktionen, der Aktivierung von T-Zellen oder der Regulation der Immunantwort. Unter physiologischen Bedingungen wird die Homöostase aufrechterhalten, unter pathologischen wird die Ausschüttung proinflammatorischer Mediatoren stimuliert. Da-her wird auch eine Beteiligung bei der Entstehung von Autoimmun- oder Entzündungskrankheiten diskutiert. Ein weiterer Punkt ist die Rolle von DC-SIGN bei der Umgehung der Immunantwort durch Viren und anderer Pathogene. Trotz des Interesses an DC-SIGN aufgrund seines möglichen therapeutischen Potentials konnten noch keine arzneimittelähnlichen Moleküle, die an die primäre Bindestelle von DC-SIGN binden, entwickelt werden, da diese sehr hydrophil ist. Vorige Studien weisen jedoch auf die Existenz von sekundären Bindestellen hin, die DC-SIGN potentiell allosterisch beeinflussen könnten. Der Mechanismus dafür ist jedoch nicht bekannt. Um die sekundären Bindestellen und das dazugehörige allosterische Netzwerk näher zu charakterisieren wurden Molecular Dynamics-Simulationen durchgeführt, die allosterische Potential für die sekundäre Bindestelle vorhersagten. Als Folge davon wurde ei-ne Hypothese über das allosterische Netzwerk von DC-SIGN erstellt. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden Mutanten des Proteins durch Austausch einzelner Aminosäuren an vielversprechenden Positionen in der Sequenz erstellt. Mit Hinblick auf das allosterische Netzwerk, könnten diese Mutationen zur Modulierung der sekundären Bindestelle führen, was wiederum Faktoren wie die Konformationsänderung, Kohlenhyd-ratspezifität, Bindungsaffinitäten und auch die primäre Bindungsstellen beeinflussen könnte. Mit funktionalen Assays können WT und Mutanten verglichen werden. Die Aufreinigung von DC-SIGN und seinen Mutanten erfolgt mittels FPLC über eine IMAC-Säule. Durch die Integration eines Autosamplers in das System ist es möglich, die automatische Aufreinigung mehrerer, verschiedener Proteinproben hintereinander zu gewährleisten. Dies erleichtert die Bereitstellung ausreichender Mengen von DC-SIGN und seinen Mutanten für weitere Experimente wie NMR und verschiedene Assays.
Abstract (eng)
SIGN is a protein of the C-type lectin superfamily and contains a characteristic car-bohydrate recognition domain that enables Ca2+-dependent binding of carbohydrates. Among other things, DC-SIGN regulates dendritic cells and influences their migration and adhesion. In addition to that, it plays an important role in inflammatory responses, activation of T-cells or regulation of the immune response. Under physiological conditi-ons, homeostasis is maintained; under pathological conditions, the release of proin-flammatory mediators is stimulated. Therefore, an involvement in the development of autoimmune or inflammatory diseases is also discussed. Another aspect is the role of DC-SIGN in evading the immune response by viruses and other pathogens. Despite the interest in DC-SIGN because of its possible therapeutic potential, no drug-like compounds which bind to the primary binding site of DC-SIGN have been develo-ped yet, because it is highly hydrophilic. However, previous studies indicate the exis-tence of secondary binding sites that could potentially allosterically affect DC-SIGN. The mechanism for this is not known though. To further characterize the secondary binding sites and the associated allosteric net-work, molecular dynamics simulations were performed which predicted allosteric poten-tials for the secondary binding site. Consequently, a hypothesis about the allosteric network of DC-SIGN was made. Based on these results, mutants of the protein were created by replacing individual amino acids at promising positions in the sequence. With respect to the allosteric network of DC-SIGN, these mutations could lead to modulation of the secondary binding site, which in turn could affect factors such as conformational change, carbohydrate specificity, binding affinities, and also primary binding sites. Func-tional assays can be used to compare WT and mutants. Purification of DC-SIGN and its mutants is performed by FPLC over an IMAC column. By integrating an autosampler into the system, it is possible to ensure automatic purifi-cation of multiple, different protein samples in succession. This facilitates the provision of sufficient amounts of DC-SIGN and its mutants for further experiments such as NMR and various assays.
Keywords (deu)
DC-SIGNC-Typ LektineKohlenhydraterkennungsdomäneProteinaufreinigungFPLCAutosamplerAllosteriefunktionale Assays
Keywords (eng)
DC-SIGNC-Type Lectinscarbohydrate recognition domainprotein purificationFPLCautosamplerallosteryfunctional assays
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1613746
rdau:P60550 (deu)
80 Seiten : Illustrationen
Number of pages
81
Association (deu)
Title (deu)
Automatisierte Herstellung rekombinanter Mutanten für die biophysikalische Charakterisierung allosterischer Modulierung in DC-SIGN
Parallel title (eng)
Automated production of recombinant mutants for biophysical characterization of allosteric modulation in DC-SIGN
Author
Gregor Suchy
Abstract (deu)
DC-SIGN ist ein Protein aus der Familie der C-Typ Lektine und besitzt eine charakteristische Kohlenhydraterkennungsdomäne, die eine Ca2+ abhängige Bindung von Kohlenhydraten ermöglicht. DC-SIGN reguliert unter anderem Dendritischen Zellen und beeinflusst deren Migration und Adhäsion. Außerdem spielt es eine wichtige Rolle bei Entzündungsreaktionen, der Aktivierung von T-Zellen oder der Regulation der Immunantwort. Unter physiologischen Bedingungen wird die Homöostase aufrechterhalten, unter pathologischen wird die Ausschüttung proinflammatorischer Mediatoren stimuliert. Da-her wird auch eine Beteiligung bei der Entstehung von Autoimmun- oder Entzündungskrankheiten diskutiert. Ein weiterer Punkt ist die Rolle von DC-SIGN bei der Umgehung der Immunantwort durch Viren und anderer Pathogene. Trotz des Interesses an DC-SIGN aufgrund seines möglichen therapeutischen Potentials konnten noch keine arzneimittelähnlichen Moleküle, die an die primäre Bindestelle von DC-SIGN binden, entwickelt werden, da diese sehr hydrophil ist. Vorige Studien weisen jedoch auf die Existenz von sekundären Bindestellen hin, die DC-SIGN potentiell allosterisch beeinflussen könnten. Der Mechanismus dafür ist jedoch nicht bekannt. Um die sekundären Bindestellen und das dazugehörige allosterische Netzwerk näher zu charakterisieren wurden Molecular Dynamics-Simulationen durchgeführt, die allosterische Potential für die sekundäre Bindestelle vorhersagten. Als Folge davon wurde ei-ne Hypothese über das allosterische Netzwerk von DC-SIGN erstellt. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden Mutanten des Proteins durch Austausch einzelner Aminosäuren an vielversprechenden Positionen in der Sequenz erstellt. Mit Hinblick auf das allosterische Netzwerk, könnten diese Mutationen zur Modulierung der sekundären Bindestelle führen, was wiederum Faktoren wie die Konformationsänderung, Kohlenhyd-ratspezifität, Bindungsaffinitäten und auch die primäre Bindungsstellen beeinflussen könnte. Mit funktionalen Assays können WT und Mutanten verglichen werden. Die Aufreinigung von DC-SIGN und seinen Mutanten erfolgt mittels FPLC über eine IMAC-Säule. Durch die Integration eines Autosamplers in das System ist es möglich, die automatische Aufreinigung mehrerer, verschiedener Proteinproben hintereinander zu gewährleisten. Dies erleichtert die Bereitstellung ausreichender Mengen von DC-SIGN und seinen Mutanten für weitere Experimente wie NMR und verschiedene Assays.
Abstract (eng)
SIGN is a protein of the C-type lectin superfamily and contains a characteristic car-bohydrate recognition domain that enables Ca2+-dependent binding of carbohydrates. Among other things, DC-SIGN regulates dendritic cells and influences their migration and adhesion. In addition to that, it plays an important role in inflammatory responses, activation of T-cells or regulation of the immune response. Under physiological conditi-ons, homeostasis is maintained; under pathological conditions, the release of proin-flammatory mediators is stimulated. Therefore, an involvement in the development of autoimmune or inflammatory diseases is also discussed. Another aspect is the role of DC-SIGN in evading the immune response by viruses and other pathogens. Despite the interest in DC-SIGN because of its possible therapeutic potential, no drug-like compounds which bind to the primary binding site of DC-SIGN have been develo-ped yet, because it is highly hydrophilic. However, previous studies indicate the exis-tence of secondary binding sites that could potentially allosterically affect DC-SIGN. The mechanism for this is not known though. To further characterize the secondary binding sites and the associated allosteric net-work, molecular dynamics simulations were performed which predicted allosteric poten-tials for the secondary binding site. Consequently, a hypothesis about the allosteric network of DC-SIGN was made. Based on these results, mutants of the protein were created by replacing individual amino acids at promising positions in the sequence. With respect to the allosteric network of DC-SIGN, these mutations could lead to modulation of the secondary binding site, which in turn could affect factors such as conformational change, carbohydrate specificity, binding affinities, and also primary binding sites. Func-tional assays can be used to compare WT and mutants. Purification of DC-SIGN and its mutants is performed by FPLC over an IMAC column. By integrating an autosampler into the system, it is possible to ensure automatic purifi-cation of multiple, different protein samples in succession. This facilitates the provision of sufficient amounts of DC-SIGN and its mutants for further experiments such as NMR and various assays.
Keywords (deu)
DC-SIGNC-Typ LektineKohlenhydraterkennungsdomäneProteinaufreinigungFPLCAutosamplerAllosteriefunktionale Assays
Keywords (eng)
DC-SIGNC-Type Lectinscarbohydrate recognition domainprotein purificationFPLCautosamplerallosteryfunctional assays
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1615023
Number of pages
81
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