Abstract (deu)
Das angeborene Immunsystem stellt die erste Verteidigungslinie gegen eindringende Pathogene dar. Zellen des angeborenen Immunsystems wie z. B. Makrophagen exprimieren Mustererkennungsrezeptoren (pattern recognition receptors), die konservierte Strukturen vieler Mikroorganismen, sogenannte Pathogen-assoziierte molekulare Muster (pathogen-associated molecular patterns), erkennen. Viren werden vorwiegend durch die Anwesenheit ihrer Genome detektiert und lösen eine Signaltransduktionskaskade aus, die zur Sekretion von Typ I Interferonen (IFNα und IFNβ) führt. Typ I Interferone sind essentiell für die Ausbildung antiviraler Immunität, da sie die Replikation des Virus hemmen und die spezifische Immunabwehr stimulieren. Allerdings sind die Signal-transduktionswege, die zur Interferoninduktion führen, nicht vollständig geklärt, und während die ersten cytosolischen Nukleinsäuresensoren entdeckt werden, häufen sich die Indizien für die Existenz weiterer, noch unbekannter Rezeptoren.
Das Ziel dieser Diplomarbeit war, neue Nukleinsäurerezeptoren, die maßgeblich zur angeborenen antiviralen Immunantwort beitragen, zu identifizieren. Im Mittelpunkt des Projekts stand die Hypothese, dass Nukleinsäurerezeptoren an Nukleinsäuren binden und von Nukleinsäuren transkriptionell reguliert werden. Folglich wurde eine Kombination aus Proteomik und Genomik als experimenteller Ansatz gewählt. Zwei Datensätze wurden generiert: Der Proteomikdatensatz enthält Proteine, die an Nukleinsäuren binden. Zu diesem Zweck wurden Pulldown- Experimente mit immobilisierten Nukleinsäuren durchgeführt um Nukleinsäure- bindende Proteine zu isolieren, die anschließend mittels Massenspektrometrie identifiziert wurden. Gene, deren Expression durch Nukleinsäure-stimulation transkriptionell reguliert werden, wurden mithilfe von Microarrays erfasst und repräsentieren den Genomikdatensatz. Basierend auf der eingangs erwähnten Hypothese, wurden die Proteine, die in beiden Datensätzen vorhanden waren, in eine Kandidatenliste aufgenommen. Zu den 24 Kandidaten zählen fünf Proteine, deren Funktion innerhalb der Nukleinsäuresignaltransduktion bereits bekannt ist, wie z. B. die Rezeptoren für doppel-strängige RNA (dsRNA) RIG-I und MDA-5. Die Tatsache, dass diese fünf Proteine Teil der Kandidatenliste sind, validiert den experimentellen Ansatz.
Nachdem die Kandidatenliste erstellt worden war, wurden die Microarray- Ergebnisse mittels real-time PCR bestätigt. Weiters wurden die Kandidaten auf ihre funktionelle Relevanz für die Entstehung einer Nukleinsäure-stimulierten antiviralen Immunantwort untersucht. Zu diesem Zweck wurde die Auswirkung des Silencings der einzelnen Kandidaten durch RNA- Interferenz auf IFNβ− Induktion aufgrund Stimulation mit Nukleinsäuren mittels real-time PCR bestimmt. Die fünf Kontrollkandidaten zeigten die erwarteten Effekte, und zwölf der restlichen 19 Kandidaten hatten einen positiven Einfluss auf die IFNβ Induktion, wenn mit dem synthetischen dsRNA- Analogon polyI:C stimuliert wurde. Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurde somit die Basis für weiterführende Untersuchungen zur Identifikation von Nukleinsäurerezeptoren geschaffen.
Parallel zu der auf RNA- Interferenz basierenden Evaluation der Kandidaten wurde das DNA- modifizierende Enzym Kandidat 4 genauer untersucht. Kandidat 4 ist ein IFNβ- induzierbares, perinukleäres Protein. Mutationen, die eine Inaktivierung von Kandidat 4 nach sich ziehen, bewirken eine schwere Erkrankung mit entzündlicher Komponente. Welche Rolle Kandidat 4 bei DNA- stimulierter IFNβ- Induktion spielt, konnte aufgrund widersprüchlicher Ergebnisse nicht geklärt werden. Weitere Versuche sind notwendig um die Funktion von Kandidat 4 zu verstehen.