Title (eng)
Radiation damage in metalloproteins
Parallel title (deu)
Strahlungsschäden in Metalloproteinen
Author
Maria Pechlaner
Advisor
Kristina Djinovic-Carugo
Assessor
Kristina Djinovic-Carugo
Abstract (deu)
Die makromolekulare Kristallographie ist eine leistungsfähige Methode zur Strukturaufklärung und basiert auf der Wechselwirkung intensiver Röntgenstrahlung mit kristallinem biologischem Material. Diese Wechselwirkung führt unter anderem auch zur Freisetzung von Elektronen aus den Atomhüllen und damit zu Ionisierungen, Entstehung von Radikalen und der Lösung chemischer Bindungen. Während sich so Schäden in den einzelnen Molekülen immer mehr anhäufen kommt es gleichzeitig zu einer fortlaufenden Zersetzung des Kristallgitters.
Das Ausmaß der Schädigung wird drastisch vermindert, wenn Experimente bei Temperaturen um 100 K durchgeführt werden, was daher heute zur Standardprozedur gehört und das Problem viele Jahre in Schach halten konnte. Mit den neuen starken Undulator-Strahlen in Synchrotronen der dritten Generation, entwickeln sich Strahlenschäden jedoch wieder zu einer bedeutenden Hürde, wenn es darum geht maximale Strukturinformation aus einem einzelnen Kristall zu gewinnen.
Der Einsatz von Elektronen- oder Radikalfängern zum Schutz der Biomoleküle gegen reaktive Spezies ist bereits in der Elektronenspektroskopie dokumentiert und mittlerweile gibt es auch in der Röntgenkristallographie vielversprechende Experimente.
Abgesehen von den gut dokumentierten globalen und strukturellen Auswirkungen, kommt es bei Metalloenzymen zusätzlich zur Reduktion des Metalls. Während sich der Oxidationszustand nicht eindeutig aus der Elektronendichte bestimmen lässte, kann er doch entscheidende Auswirkungen auf die Koordination des Metalls und damit seine strukturelle Umgebung haben.
In der vorliegenden Arbeit haben wir verschiedene Radikalfänger auf ihren möglichen Schutzeffekt für Metalloproteine hin untersucht. Kristalle wurden mit Lösungen ausgewählter Substanzen durchtränkt und anschließend Diffraktionsexperimente am ESRF (European Synchrotron Radiation Facility, Grenoble), bei der Berliner Elektronenspeicherring-Gesellschaft für Synchrotronstrahlung (BESSY) und am institutseigenen Rotationsanoden-Instrument durchgeführt. Die gesammelten Datensets wurden in fünf aufeinanderfolgende Subsets mit steigender Strahlendosis aufgeteilt, anhand derer die kumulativen lokalen und globalen Strahlenschäden evaluiert werden konnten. Ein besonderer Schwerpunkt lag dabei auf dem Oxidationszustand des Metalls, der mit Hilfe eines UV-vis Mikrospektrophotometers genau festgestellt werden konnte.
Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass Radikalfänger wahrscheinlich nicht im Stande sind, die Reduktion eines Metalls wesentlich zu verringern. DNQ, HEPES und das schon als wirksamer Scavenger beschriebene Askorbat kann möglicherweise eine schützende Wirkung zugeschrieben werden und sie bieten sich für weiterführende Tests an.
Abstract (eng)
The elucidation of high resolution macromolecular structures depends largely on the application of brilliant X-ray radiation to biological matter in crystalline form, which is the basis of macromolecular crystallography. When X-rays interact with organic matter a plethora of electrons is ejected from atomic shells leading to ionizations, formation of radicals and breakage of bonds. In summary, this leads to accumulating damage of protein molecules and as a consequence to progressing deterioration of the crystal lattice.
The rate of damage is reduced dramatically when experiments are done at 100K in a nitrogen stream, which has become a standard technique and kept the problem under control for many years. Today, however, in strong undulator beamlines at third generation synchrotrons radiation damage is re-emerging as a major limiting factor to the amount of information that can be obtained from one crystal.
The use of electron or radical scavengers to reduce the load of reactive species and thereby protect biological macromolecules has been described for electron spectroscopy and in analogy promising experiments have been conducted in macromolecular X-ray crystallography.
Apart from the well-described global and structural damage, enzymes containing metal co-factors run an additional risk. It has been shown that reduction of the metal is one of the first events happening. While the redox state can not be determined from the electron density measured experimentally, it can have critical impact on the metal's structural environment.
In the present work the influence of a range of possible electron scavengers on the damage suffered by crystals of model metalloproteins was investigated. For that purpose, proteins were crystallized and soaked in scavenger solutions. Data was collected from azurin, insulin and myoglobin at three different stations: the ESRF (European Synchrotron Radiation Facility, Grenoble), at BESSY (Berliner Elektronenspeicherring-Gesellschaft für Synchrotronstrahlung) and at the rotating anode home source present at the institute. After processing the data in five consecutive subsets of increasing dose, local and global effects of radiation damage were evaluated. A special focus was given to the metal oxidation state, which was determined by UV-vis microspectrophotometry experiments.
Our results suggest that scavengers are not able to prevent the reduction of the metal. Nonetheless, DNQ, hepes and the previously reported scavenger ascorbate, might have a small protective effect and would be candidates for further tests.
Keywords (eng)
macromolecular crystallographyradiation damagemetalloproteinselectron scavengers
Keywords (deu)
ProteinkristallographieStrahlungsschädenMetalloproteineRadikalfänger
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1249063
rdau:P60550 (deu)
122 S.
Number of pages
122
Association (deu)
Title (eng)
Radiation damage in metalloproteins
Parallel title (deu)
Strahlungsschäden in Metalloproteinen
Author
Maria Pechlaner
Abstract (deu)
Die makromolekulare Kristallographie ist eine leistungsfähige Methode zur Strukturaufklärung und basiert auf der Wechselwirkung intensiver Röntgenstrahlung mit kristallinem biologischem Material. Diese Wechselwirkung führt unter anderem auch zur Freisetzung von Elektronen aus den Atomhüllen und damit zu Ionisierungen, Entstehung von Radikalen und der Lösung chemischer Bindungen. Während sich so Schäden in den einzelnen Molekülen immer mehr anhäufen kommt es gleichzeitig zu einer fortlaufenden Zersetzung des Kristallgitters.
Das Ausmaß der Schädigung wird drastisch vermindert, wenn Experimente bei Temperaturen um 100 K durchgeführt werden, was daher heute zur Standardprozedur gehört und das Problem viele Jahre in Schach halten konnte. Mit den neuen starken Undulator-Strahlen in Synchrotronen der dritten Generation, entwickeln sich Strahlenschäden jedoch wieder zu einer bedeutenden Hürde, wenn es darum geht maximale Strukturinformation aus einem einzelnen Kristall zu gewinnen.
Der Einsatz von Elektronen- oder Radikalfängern zum Schutz der Biomoleküle gegen reaktive Spezies ist bereits in der Elektronenspektroskopie dokumentiert und mittlerweile gibt es auch in der Röntgenkristallographie vielversprechende Experimente.
Abgesehen von den gut dokumentierten globalen und strukturellen Auswirkungen, kommt es bei Metalloenzymen zusätzlich zur Reduktion des Metalls. Während sich der Oxidationszustand nicht eindeutig aus der Elektronendichte bestimmen lässte, kann er doch entscheidende Auswirkungen auf die Koordination des Metalls und damit seine strukturelle Umgebung haben.
In der vorliegenden Arbeit haben wir verschiedene Radikalfänger auf ihren möglichen Schutzeffekt für Metalloproteine hin untersucht. Kristalle wurden mit Lösungen ausgewählter Substanzen durchtränkt und anschließend Diffraktionsexperimente am ESRF (European Synchrotron Radiation Facility, Grenoble), bei der Berliner Elektronenspeicherring-Gesellschaft für Synchrotronstrahlung (BESSY) und am institutseigenen Rotationsanoden-Instrument durchgeführt. Die gesammelten Datensets wurden in fünf aufeinanderfolgende Subsets mit steigender Strahlendosis aufgeteilt, anhand derer die kumulativen lokalen und globalen Strahlenschäden evaluiert werden konnten. Ein besonderer Schwerpunkt lag dabei auf dem Oxidationszustand des Metalls, der mit Hilfe eines UV-vis Mikrospektrophotometers genau festgestellt werden konnte.
Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass Radikalfänger wahrscheinlich nicht im Stande sind, die Reduktion eines Metalls wesentlich zu verringern. DNQ, HEPES und das schon als wirksamer Scavenger beschriebene Askorbat kann möglicherweise eine schützende Wirkung zugeschrieben werden und sie bieten sich für weiterführende Tests an.
Abstract (eng)
The elucidation of high resolution macromolecular structures depends largely on the application of brilliant X-ray radiation to biological matter in crystalline form, which is the basis of macromolecular crystallography. When X-rays interact with organic matter a plethora of electrons is ejected from atomic shells leading to ionizations, formation of radicals and breakage of bonds. In summary, this leads to accumulating damage of protein molecules and as a consequence to progressing deterioration of the crystal lattice.
The rate of damage is reduced dramatically when experiments are done at 100K in a nitrogen stream, which has become a standard technique and kept the problem under control for many years. Today, however, in strong undulator beamlines at third generation synchrotrons radiation damage is re-emerging as a major limiting factor to the amount of information that can be obtained from one crystal.
The use of electron or radical scavengers to reduce the load of reactive species and thereby protect biological macromolecules has been described for electron spectroscopy and in analogy promising experiments have been conducted in macromolecular X-ray crystallography.
Apart from the well-described global and structural damage, enzymes containing metal co-factors run an additional risk. It has been shown that reduction of the metal is one of the first events happening. While the redox state can not be determined from the electron density measured experimentally, it can have critical impact on the metal's structural environment.
In the present work the influence of a range of possible electron scavengers on the damage suffered by crystals of model metalloproteins was investigated. For that purpose, proteins were crystallized and soaked in scavenger solutions. Data was collected from azurin, insulin and myoglobin at three different stations: the ESRF (European Synchrotron Radiation Facility, Grenoble), at BESSY (Berliner Elektronenspeicherring-Gesellschaft für Synchrotronstrahlung) and at the rotating anode home source present at the institute. After processing the data in five consecutive subsets of increasing dose, local and global effects of radiation damage were evaluated. A special focus was given to the metal oxidation state, which was determined by UV-vis microspectrophotometry experiments.
Our results suggest that scavengers are not able to prevent the reduction of the metal. Nonetheless, DNQ, hepes and the previously reported scavenger ascorbate, might have a small protective effect and would be candidates for further tests.
Keywords (eng)
macromolecular crystallographyradiation damagemetalloproteinselectron scavengers
Keywords (deu)
ProteinkristallographieStrahlungsschädenMetalloproteineRadikalfänger
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1249064
Number of pages
122
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