Cell biological characterization of stomatin-like protein-1 (SLP-1) and stomatin

Mario Heinz Mairhofer

doi:10.25365/thesis.512

You are here: University of Vienna PHAIDRA Detail o:1249166

Title (eng)

Cell biological characterization of stomatin-like protein-1 (SLP-1) and stomatin

Parallel title (deu)

Zellbiologische Charakterisierung von Stomatin-like protein-1 (SLP-1) und stomatin

Parallel title (eng)

Cell biological characterization of stomatin-like protein-1 (SLP-1) and stomatin

Author

Mario Heinz Mairhofer

Advisor

Rainer Prohaska

Assessor

Lukas A. Huber

Andreas Hartig

Abstract (deu)

Die humane Stomatin-Proteinfamilie besteht aus 5 Mitgliedern, dem Prototypen Stomatin, Stomatin-like protein 1 (SLP-1), SLP-2, SLP-3 und das Nieren-spezifische Podocin-Protein, deren genaue Funktion noch weitgehend unbekannt ist. Das geringe Wissen über diese Proteinfamilie kann durch die hydrophobe Natur und die enge Assoziierung dieser Proteine mit Membranen erklärt werden, da diese Faktoren noch immer eine große Herausforderung für Biochemiker und Zellbiologen darstellen. Genetische Daten aus dem Modellorganismus C. elegans, knock-out Experimente in Mäusen und genetische Daten von Patienten mit Steriod-Resistant Nephrotic Syndrome lassen auf eine wichtige, aber wahrscheinlich redundante Funktion für diese Proteine schließen. Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf dem humanen SLP-1 Protein, dem am wenigsten charakterisierten Familienmitglied. Da kein Antikörper gegen das humane SLP-1 Protein erhältlich war, habe ich das SLP-1-Protein mit unterschiedlichen Tags verknüpft (GFP, myc-Epitop und HA-Epitop) und exogen exprimiert und die Fusionsproteine mit biochemischen und zellbiologischen Methoden charakterisiert. In Analogie zu Stomatin wurde das getaggte SLP-1-Protein auf perinucleären Vesikeln detektiert, zeigte aber im Gegensatz zu Stomatin keine Plasmamembran-Lokalisation in der Immunfluoreszenz- und Immunoelektronen-Mikroskopie. Subzelluläre Fraktionierung und biochemische Analyse bestätigten die endosomale Lokalisation. Durch Vergleich der Lokalisation von SLP-1 mit unterschiedlichen Organellenmarkern in Immunfluoreszenz-Versuchen konnte gezeigt werden, dass es sich bei den perinucleären, SLP-1-positiven Vesikeln um Late Endosomes (LEs) handelt. Die Co-Lokalisation mit unterschiedlichen Markern für dieses Kompartiment war variabel und wies auf eine breite Verteilung von SLP-1 über die diversen LE-Subkompartments hin. Die Konstruktion von verschiedenen Verkürzungs- und Punkt-Mutanten des SLP-1-Proteins führte zur Identifizierung eines Tyrosin-basierenden N-terminalen Sortiersignals in den ersten 10 Aminosäuren des Proteins. In chimären Konstrukten, in denen der N-terminus des Stomatin-Proteins durch den N-Terminus von SLP-1 ersetzt wurde, war dieses Motiv hinreichend, um das Fusionsprotein zu LEs/Lysosomen zu dirigieren und die Plasma-Membran-Lokalisation von stomatin zu unterbinden. C-Terminale Deletionsmutanten von SLP-1 zeigen auch Auswirkungen auf die korrekte subzelluläre Lokalisierung, wie am Beispiel eines Konstruktes klar wurde, welches zu cytoplasmatischen Aggregaten und tubulären Strukturen fehlgeleitet wird. Diese C-terminale Verkürzung wurde in Elektronenmikroskopie-Experimenten untersucht, und es konnte gezeigt werden, dass die zytoplasmatischen Aggregate kleine Lipid Bodies (alternativer Name Lipid Droplets) darstellen. Wahrscheinlich führte die Über-Expression der SLP-1-Verkürzungsmutante zur Ausbildung dieser charakteristischen Strukturen. Unsere Hypothese, dass die menschlichen SLP-1- und stomatin-Proteine einen Komplex bilden könnten wie ihre C. elegans Gegenstücke UNC-24 und UNC-1, wurde in dieser Arbeit verifiziert. Komplexbildung zwischen endogenem Stomatin und exogen exprimiertem, getaggtem SLP-1 konnte in Immunpräzipitations-Experimenten gezeigt werden. Beide Proteine ko-lokalisierten in Immunfluoreszenz-Experimenten auf Late Endosomes, und interessanterweise veränderte sich die Lokalisation von endogenem Stomatin bei Überexpression von SLP-1, wobei eine klare Verschiebung von der Plasmamembran zu Late Endosomes festzustellen war. Diese Daten verweisen darauf, dass hetero-oligomere Komplexe zwischen Stomatin und SLP-1 gebildet werden, und dass sich die Eigenschaften dieser hetero-oligomeren Komplexe von den bekannten homo-oligomeren Stomatin-Komplexen stark unterscheiden könnten. Biochemische und zellbiologische Ergebnisse unterstützen eine oligomere Struktur von SLP-1. Wie Stomatin ist auch SLP-1 in sogenannten Detergent-Resistant Membranes (DRMs) oder Lipid Rafts angereichert, obwohl es nicht an der Plasmamembran zu finden ist. Einer der Hauptunterschiede zwischen SLP-1 und Stomatin wurde in Bezug auf die Assoziierung mit Lipid bodies/droplets festgestellt. Wild-Typ SLP-1 wurde nie auf der Oberfläche dieser Lipid-Speicherorganellen detektiert, wohingegen sowohl Stomatin als auch eine C-terminale Verkürzung von SLP-1 auf Lipid bodies detektiert wurden und die charakteristische, ringförmige Färbung zeigten. Basierend auf der einzigartigen Domänenstruktur von SLP-1, welches eine Kombination von einer Stomatin–Domäne und einer Sterol Carrier Protein-2 (SCP-2)-Domäne beinhaltet, und auf der Anreicherung in lipid rafts, kamen wir zu der Annahme, dass eine Funktion des Proteins im Cholesterin/Lipid-Transport möglich ist. Ich verwendete den Farbstoff Filipin, um die subzelluläre Verteilung von Cholesterin in Zellen, die SLP-1 überexprimieren, zu untersuchen. Dabei fand ich keine augenfälligen Unterschiede zu Kontroll-Zellen. Aber als ich den Cholesterin-Transport von den Late Endosomes zur Plasma-Membran mit einem synthetischen Aminosteroid inhibierte, fand ich große Unterschiede zwischen Kontrollzellen und SLP-1-exprimierenden Zellen. Überexpression von SLP-1 führte zur Bildung von stark vergrößerten, Cholesterin-gefüllten perinukleären Strukturen. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Cholesterin-Verteilung im Late-endosomalen Kompartment durch die Expression von SLP-1 verändert werden kann. Eine Verkürzungsmutante, bei der die SCP-2-Domäne entfernt wurde, zeigte diesen Effekt nicht, wodurch gezeigt wird, dass diese Domäne für die Modifizierung der Cholesterin-Verteilung notwendig ist. Live-Cell-Imaging gab schließlich Aufschlüsse über die Dynamik des SLP-1-Proteins auf den perinukleären Vesikeln und zeigte, dass das SLP-1-Protein meist sehr inhomogen auf der Oberfläche von größeren Vesikeln verteilt ist und dass es einen zweiten Pool von kleineren, sehr schnell diffundierenden Vesikeln gibt. Diese kleinen Vesikel können entweder kurzfristig mit größeren Strukturen interagieren, oder sie fusionieren und schnüren sich dann wieder als diskrete Einheiten von den größeren Vesikeln ab. Worum es sich bei diesen kleinen, schnellen Strukturen genau handelt, muss erst geklärt werden. In einem zweiten Teil meiner Arbeit versuchte ich unser Wissen über das stomatin-Protein selbst zu erweitern. Ich konnte einen Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)-Assay etablieren und zeigen, dass die Deletion des äußersten C-Terminus von Stomatin die Diffusionseigenschaften des Proteins in der Plasmamembran beeinflusst. Sowohl die mobile Fraktion als auch die Diffusionsgeschwindigkeit erhöhen sich, sobald der C-Terminus, der auch für die Oligomerisierung und die Lipid-Raft-Assoziierung notwendig ist, deletiert ist. Um potentielle Interaktionspartner und funktionelle Mechanismen, bei denen Stomatin eine Rolle spielen könnte, auszumachen, führte ich 2D-PAGE-Analysen von Thrombozyten-DRM-Fraktionen durch und ließ die Proteine und post-translationelle Modifikationen (PTMs) von Stomatin durch Massenspektrometrie identifizieren (Mass Spectrometry Unit, VBC). In unaktivierten Thrombozyten wurden 3 Spots für Stomatin gefunden, einer nahe am theoretischen iso-elektrischen Punkt, und zwei zur sauren Seite verschobene Spots, die eine bzw. zwei zusätzliche negative Ladungen darstellen könnten. Die massenspektroskopische Analyse auf PTMs ergab eine potentielle neue Phosphorylierungsstelle für Stomatin (Serin-231) und eine kryptische, bis jetzt unbekannte Modifikation, die auf drei aufeinanderfolgenden Stomatin-Peptiden gefunden wurde. Die Natur und Bedeutung dieser Modifikation muss erst genauer untersucht werden. Schließlich habe ich in einem letzten Ansatz versucht, das zunehmende Wissen über Mutationen in den Stomatin-verwandten Proteinen MEC-2 und UNC-1 in C. elegans für die Untersuchung des humanen Proteins auszunutzen. Ich habe zuerst konservierte Aminosäuren in der Sequenz identifiziert, bei denen Mutationen einen Phänotyp im Wurm verursachen. Dann habe ich die entsprechenden Punktmutationen im humanen Stomatin-Protein konstruiert. Die Analyse dieser Punktmutationen steht erst am Anfang, aber erste Ergebnisse lassen vermuten, dass diese Strategie zu neuen Einsichten in die Transport- und Targeting-Mechanismen des Proteins führen werden.

Abstract (eng)

The human stomatin protein family consists of 5 members, the prototype stomatin protein, stomatin-like protein 1 (SLP-1), SLP-2, SLP-3, and the kidney-specific podocin protein, whose precise functions have remained largely unknown up to now. This lack of knowledge may be explained by the hydrophobic nature and the tight membrane association of these proteins, which still pose a challenge for the biochemist and molecular cell biologist. Nevertheless, genetic data from C. elegans stomatin-like proteins UNC-1, UNC-24, and MEC-2 as well as knock-out experiments in mice (stomatin, SLP-2, SLP-3) and analysis of genetic data in human steroid-resistant nephrotic syndrome (podocin) indicate an important, but perhaps redundant function for these proteins in most tissues. In this work, the major focus was put on human SLP-1 protein, the least characterized family member. Due to the lack of an antibody against SLP-1, I prepared SLP-1 constructs fused to different tags (GFP, myc-epitope, HA-epitope) and exogenously expressed and characterized the tagged proteins with biochemical and molecular cell biological methods. Similar to stomatin, the tagged SLP-1 protein was localized to perinuclear vesicles, however, in contrast to stomatin it was not found on the plasma membrane by immunofluorescence and immunoelectron microscopy. Subcellular fractionation and biochemical analysis confirmed the endosomal localization. Comparison of the localization of SLP-1 with different organelle marker proteins by immunofluorescence studies revealed that these peri-nuclear vesicles are late endosomes/lysosomes. The degree of co-localization between SLP-1 and different late endosomal/lysosomal markers was variable and indicated a broad distribution of the protein over different late endosomal sub-compartments. Several truncation mutants and point mutants of the SLP-1 protein were constructed and led to the identification of a tyrosine-based N-terminal late endosomal/lysosomal targeting signal in the first 10 amino acids of the protein. In chimeric constructs, where the N-terminus of stomatin was replaced by the N-terminus of SLP-1, this motif was found to be sufficient to direct the fusion protein to late endosomes/lysosomes and abolish the plasma membrane localization of stomatin. C-terminal deletions of SLP-1 also compromise the correct subcellular localization of this protein, as exemplified by one construct, which was found to be mis-targeted to cytoplasmic aggregates and tubular structures. This truncation was also analyzed by electron microscopy and the cytoplasmic aggregates were found to be small lipid bodies or droplets. Most likely, the over-expression of the SLP-1 truncation mutant was the cause for the appearance of these characteristic structures. Our hypothesis that the human SLP-1 and stomatin proteins could form a complex like their C. elegans counterparts UNC-24 and UNC-1 was tested in this thesis and the interaction between endogenous stomatin and exogenously expressed, tagged SLP-1 was verified by co-immunoprecipitation analyses. These two proteins also showed co-localization in immunofluorescence experiments, and most importantly, over-expression of SLP-1 caused a re-distribution of endogenous stomatin from the plasma membrane to late endosomes. These data strongly support the notion that hetero-oligomeric complexes between stomatin and SLP-1 are formed, whose functional properties might differ from the known stomatin homo-oligomers. Biochemical and cell biological evidence indicates that SLP-1 forms an oligomeric structure. Like the prototype stomatin protein, SLP-1 is enriched in detergent-resistant membranes (DRMs), similar to lipid rafts, although it is not present at the plasma membrane. A major difference between stomatin and SLP-1 was found in respect to the targeting to lipid bodies/droplets. Wild-type SLP-1 was never detected on these neutral lipid storage organelles, whereas stomatin and a C-terminal truncation mutant of SLP-1 were readily detected there and showed the characteristic ring-shaped appearance. Based on the unique domain structure of SLP-1, containing a stomatin and a sterol carrier protein-2 (SCP-2) domain, and its enrichment in lipid rafts, we supposed that the protein could function in cholesterol/lipid transport. I used filipin staining to analyze the subcellular distribution of cholesterol in cells exogenously expressing SLP-1 and found no obvious differences to control cells. But when I blocked the transport of cholesterol from the late endosomal compartment to the plasma membrane with a synthetic aminosteroid, I encountered big differences between cells expressing SLP-1 and control cells. Over-expression of SLP-1 caused the formation of enlarged, cholesterol-filled perinuclear structures. This means that the distribution of cholesterol in the late endosomal compartment can be modified by the expression of SLP-1. A truncation mutant in which the SCP-2 domain of SLP-1 was deleted did not show this effect, indicating that this domain is necessary to modify cholesterol distribution. Finally, live cell imaging of SLP-1-GFP revealed the dynamics of SLP-1 on perinuclear vesicles and led to the finding that the protein is inhomogeneously distributed on the surface of big endosomal structures and that smaller, rapidly diffusing vesicles are also positive for SLP-1-GFP. These small vesicles either transiently attach to the bigger structures or fuse and pinch off these structures as discrete entities. The precise nature of these transport intermediates remains to be clarified. In a second part of my work, I tried to expand our knowledge about the prototype family member, the stomatin protein. I established a fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) assay and demonstrated that deletion of the outermost C-terminus of stomatin modifies the diffusion properties of this protein. The mobile fraction and the diffusion speed both increase when the outermost C-terminus, which is essential for oligomerization and lipid raft association, is deleted. To identify potential interaction partners and functional mechanisms where stomatin could play a role, I performed 2D PAGE analyses of platelet DRM fractions and identified the proteins and post-translational modifications (PTMs) of stomatin by mass spectrometry (at the Mass Spectrometry Unit). In resting platelets, the protein was detected in 3 separate spots, one close to the theoretical isoelectric point and two spots shifted towards the acidic end, which may correspond to one and two additional negative charges, respectively. The mass spectrometric analyses for PTMs revealed a potential novel phosphorylation site (serine-231) and a cryptic, yet unknown modification, which was detected on three consecutive stomatin peptides. The significance of these modifications remains to be determined. Finally, another strategy was taking advantage of the increasing number of reported mutations in the C. elegans stomatin homologues MEC-2 and UNC-1. I identified conserved residues, whose mutations cause a phenotype in the worm, and constructed the respective point mutations in the human stomatin protein. The analyses of the mutants are only at the beginning but indicate that this strategy will lead to new insights in the mechanisms which direct the subcellular targeting and transport of this protein.

Keywords (eng)

SLP-1stomatinlipid raftslate endosomescholesterol-TransportU18666ALE-targeting signal

Keywords (deu)

SLP-1StomatinLipid raftsLate endosomesCholesterin-TransportU18666ALE-Targeting-Signal

Subject (deu)

Molekularbiologie

Subject (deu)

Biochemie: Allgemeines

Subject (deu)

Zellbiologie

Type (deu)

Dissertation