Während der mitotischen Phase des Zellzyklus’ verteilen Zellen ihre Chromsomen auf die zwei neu entstehenden Zellen. Dieser Prozess ist begleitet von immensen morphologischen Veränderungen wie zum Beispiel dem Abbau der Kernhülle, der Verdichtung der Chromosomen, dem Aufbau der mitotischen Spindel, der Chromosomenaufteilung und schließlich der Zytokinese. Die biochemischen Mechanismen, die diesen Prozessen zugrunde liegen und diese regulieren sind bisher erst wenig verstanden. Einige Proteinkomplexe wurden als die wichtigsten Regulatoren der Mitose identifiziert. Die Aktivität der Cyclin-dependent Kinase 1 im Komplex mit Cyclin B 1 (CDK1/CCNB1) ist essentiell für den Eintritt in die Mitose und frühe mitotische Vorgänge, während der Anaphase-promoting Complex (APC/C) die Anaphase und das Ende der Mitose einleitet. Einige andere mitotische Proteinkomplexe wurden identifiziert, doch für die meisten Proteine, die wichtig für den Verlauf der Mitose sind, sind nur wenige oder gar keine Interaktionspartner bekannt. Um die biochemischen Mechanismen der Mitose besser zu verstehen, ist es nötig, ein umfassenderes Bild der Proteinkomplexe, die für die Regulation der Mitose wichtig sind, zu bekommen. Die kürzlich etablierte BAC TransgeneOmics pipeline ermöglichte die Herstellung einer großen Anzahl von menschlichen Zellen, die „localisation and affinity purification“ (LAP) getaggte Mausgene von ihrem endogenen Promoter exprimieren. Aus diesen Zellen konnten wir erfolgreich 175 mitotische Proteine aufreinigen und 787 spezifisch-interagierende Proteine mittels Massenspektrometrie identifizieren. Die weitere Analyse dieser Daten mit Hilfe bioinformatischer Methoden ergab 130 potentielle Proteinkomplexe, von denen bis dahin 71 unbekannt waren. Eine weitergehende Untersuchung einiger dieser Komplexe bestätigte einen neuen Komplex, der möglicherweise bei der Funktion des Zentrosoms eine Rolle spielt, sowie zwei neue Interaktionspartner des gamma-tubulin ring complex (gamma-TuRC) und eine neue APC/C Untereinheit. Unsere Ergebnisse sind der erste Schritt, um die Organisation der mitotischen Proteinkomplexe gründlicher zu verstehen. Weitergehende Untersuchungen dieser identifizierten Proteinkomplexe werden unser Verständnis der molekularen Basis der mitotischen Regulation weiter voranbringen. Einige der wichtigsten Regulatoren, die den Eintritt und den Verlauf der Mitose kontrollieren sind mitotische Proteinkinasen. Die Phosphorylierung einer unbekannten Anzahl von Substraten wirkt wahrscheinlich wie ein Schalter, der die Aktivität, Stabilität und Lokalisierung dieser Substrate verändert. Dies löst die drastischen morphologischen Veränderungen aus, die nötig sind, damit Zellen zuverlässig durch die Mitose gehen und die mitotische Teilung vollziehen. CDK1/CCNB1 war das erste Mitglied der Familie der mitotischen Kinasen von der einige weitere identifiziert worden sind. Die Polo-like kinase 1 (PLK1) ist essentiell für die Mitose und ist an der Regulation vieler mitotischer Ereignisse beteiligt. Der Kontakt von PLK1 mit Substraten wird wahrscheinlich durch die Substratphosphorylierung von CDK1, aber vielleicht auch von PLK1 selbst kontrolliert. Aurora kinase B (AURKB) ist eine weitere essentielle mitotische Kinase, die, abgesehen von anderen Funktionen, essentiell für den „spindle assembly checkpoint“ ist, indem sie inkorrekte Mikrotubuli-Kinetochore Verbindungen korrigiert. PLK1 und AURKB sind nur in der Mitose aktiv und ihre Lokalisierung ist streng reguliert. Das lässt vermuten, dass PLK1 und AURKB Substrate nur zu einer bestimmten Zeit und an einem bestimmten Ort phosphoryliert werden dürfen um ihre Funktion zu erfüllen. Versuche zum Detektieren von Kinase Substraten sind bisher allerdings meist in vitro durchgeführt worden, also in der Abwesenheit jeglicher zellulärer Kontrollmechanismen. Wir haben deshalb eine Zell-basierte Methode entwickelt, um neue PLK1 und AURKB Substrate zu finden. Mit Inhibitoren aus kleinen Molekülen gegen PLK1 und AURKB in Kombination mit LAP-Aufreinigung und Massenspektrometrie konnten wir Kinase-abhängige Phosphorylierungsstellen auf 16 potentiellen Substratkomplexen detektieren. Insgesamt haben wir 470 Phosphorylierungsstellen gefunden, von denen 41 PLK1- und 20 AURKB-abhängig waren. Wir haben einen Teil dieser Phosphorylierungsstellen mit Phospho-spezifischen Antikörpern validiert und 17 neue potentielle PLK1 Substrate sowie 18 neue potentielle AURKB Substrate gefunden.

During the mitotic phase of the cell cycle cells equally distribute their chromosomes into two daughter cells. This process is accompanied by immense morphological changes such as breakdown of the nuclear envelope, chromosome condensation, mitotic spindle assembly, chromosome segregation and finally cytokinesis. The underlying biochemical mechanisms regulating these processes are only beginning to be understood. A number of protein complexes have been identified as the major mitotic regulators. The activity of cyclin-dependent kinase 1 bound to cyclin B (CDK1/CCNB1) is essential for entry into mitosis and early mitotic events while the activity of the anaphase-promoting complex (APC/C) initiates anaphase onset and mitotic exit. Some other mitotic protein complexes have been identified but for most proteins involved in mitotic progression only few or no binding partners are known. To better understand the biochemical mechanisms that govern mitosis, a more comprehensive picture of the protein complexes involved in mitotic regulation is necessary. The recently established BAC TransgeneOmics pipeline allowed the generation of a large set of human cells expressing localisation and affinity purification (LAP)-tagged mouse genes from their endogenous promoter. Using these cells we successfully purified 175 mitotic bait proteins and identified 787 specific interaction partners by mass spectrometry (MS). Further analysis of this dataset using computational methods predicted 130 protein complexes of which 71 were previously unknown. Some of those complexes and interacting partners were tested further to confirm one novel protein complex potentially involved in centrosome function, two novel interaction partners of the gamma-tubulin ring complex (gamma-TuRC) and one novel APC/C subunit. Our study provides the first step towards more comprehensively understanding mitotic protein complex organisation. Further studies of these identified protein complexes will advance our understanding of the molecular basis of mitotic regulation. One of the key regulators that control entry and progression through mitosis are mitotic protein kinases. Phosphorylation of an unknown number of substrates is thought to act like a switch that changes activity, stability and localisation of these substrates. This triggers the drastic morphological changes that are necessary for cells to faithfully progress through and complete a mitotic division. CDK1/CCNB1 was the first member of the mitotic protein kinase family but several more have been identified. The Polo-like kinase 1 (PLK1) is essential for mitosis and has been implicated in the regulation of many events during mitosis. Targeting of PLK1 to its substrates is thought to be controlled by priming phosphorylation by CDK1 but might, for some substrates, also be regulated through PLK1’s own activity. Aurora kinase B (AURKB) is another essential mitotic kinase which, apart from other functions, is essential for spindle assembly checkpoint function by correcting improper microtubule kinetochore attachments. The activity of PLK1 and AURKB is limited to mitosis and their localisation is tightly regulated. This suggests that PLK1 and AURKB substrates must only be phosphorylated at a specific time and place to fulfil their function. Assays to detect kinase substrates have been, however, largely carried out in vitro, without any cellular regulatory systems in place. We have therefore set out to develop a cellular assay to find novel PLK1 and AURKB substrates. Using small molecule inhibitors against PLK1 and AURKB in combination with LAP purification and MS we could detect kinase-dependent phosphorylation sites on 16 candidate substrate complexes. In total we found 470 phosphorylation sites, 41 of which were PLK1-dependent and 20 of which were AURKB-dependent. We validated a subset of these sites with phospho-specific antibodies and detected 17 novel potential PLK1 substrates and 18 novel potential AURKB substrates.