Title (eng)
Investigation of a phospho-histone H3 based histone code during transcriptional activation
Parallel title (deu)
Untersuchung eines auf phospho-Histone H3 basierenden Histone Codes während der transkriptionellen Induktion
Author
Stefan Winter
Advisor
Christian Seiser
Assessor
Gernot Längst
Christian Schöfer
Abstract (deu)
DNA liegt innerhalb des eukaryontischen Zellkerns in Form eines dynamischen Nukleoprotein-Komplexes vor, der als „Chromatin“ bezeichnet wird. Die elementare Untereinheit des Chromatinpolymers ist das Nukleosom, ein DNA-Protein-Komplex, welcher je zwei Kopien der vier Histone H2A, H2B, H3 und H4 beinhaltet.
Post-translationelle Modifikationen (PTM) der N-Termini von Histonen, wie zum Beispiel Methylierung, Azetylierung oder Phosphorylierung stellen zentrale Elemente in der Chromatin-Biologie dar. Entsprechend der „Histonecode“-Hypothese vermitteln PTM diese Funktion durch die Rekrutierung von modifikationsabhängigen Faktoren (Detektorproteinen), durch die schließlich die Chromatin-Architektur verändern.
Während der Interphase korreliert die Phosphorylierung von Serin10 an Histone H3 mit der Transkription einer spezifischen Gruppe von Genen, einschließlich des HDAC1-Gens. Außerdem trifft diese spezielle Modifikation häufig mit Azetylierung von Lysin9 oder 14 desselben Histon H3 Moleküls zusammen, weswegen diese Doppel-Modifikation auch oft als „Phosphoazetylierung“ bezeichnet wird.
Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der Phosphorylierung/ Phosphoazetylierung von Histon H3 während der Transkription zu untersuchen und zu prüfen, ob mehrere unterschiedliche Modifikationen in diesem Prozess zusammenwirken.
14-3-3 Proteine wurden als „Detektor Proteine“ für phosphoryliertes Histon H3 identifiziert. Interaktionsmessungen in vitro zeigten, dass die schwache Interaktion zwischen 14-3-3 und Serin10 phosphoryliertem Histon H3 durch kombinatorische Modifikationsmuster moduliert wird: Serin10 Phosphorylierung ist für eine signifikante Interaktion notwendig, aber zusätzliche Azetylierung von Lysin9 oder Lysin14 erhöht die Affinität von 14-3-3 für Histon H3. Lysin9 wird neben Azetylierung auch in transkriptionell unterdrücktem Chromatin methyliert. Massenspektroskopische Studien zeigen, dass Phosphoacetylierung mit Lysine9 Methylierung in vivo zusammentrifft. Diese dreifach modifizierte Spezies wird in vitro effizient durch 14-3-3 gebunden. Dies lässt den Schluß zu, dass Histone Phosphorylierung und Azetylierung kooperieren, um temporär die reprimierende Lysine9 Methylierung „auszublenden“, während die epigenetische Information dieser Modifikation erhalten bleibt. Chromatinimmunopräzipitations-Experimente zeigen, dass die Lokalisierung von 14-3-3 Proteinen am HDAC1 Promoter abhängig von Histone H3 Phosphorylierung ist. Diese Rekrutierung wird durch zusätzliche H3 Azetylierung verstärkt und korreliert mit der Dissoziation des transkriptionellen Repressors HP1γ. siRNA vermittelte Abreicherung von 14-3-3 Proteinen unterbindet die transkriptionelle Induktion von HDAC1, was darauf hindeutet, dass 14-3-3 Proteine das Phosphoazetylierungs-Signal an die Transkriptions-Maschinerie weiterleiten. Zusammenfassend zeigen die präsentierten Daten, dass 14-3-3 Proteine zentrale Mediatoren des H3 Phosphoazetylierungs-Signals während der transkriptionellen Induktion sind.
Abstract (eng)
Within eukaryotic nucleus, DNA is organized into a structural dynamic nucleoprotein complex designated “chromatin”. The fundamental subunit of the chromatin polymer is constituted by the nucleosome, an octameric protein-DNA complex composed of four different histone species, histone H2A, H2B, H3 and H4.
Posttranslational modifications (PTM) of histone amino-terminal tails such as methylation, phosphorylation or acetylation are pivotal elements in chromatin biology. According to the “histone code” hypothesis, PTMs exert their function via the recruitment of modification dependent binding factors (detector proteins) that finally modulate chromatin architecture.
In interphase phosphorylation of serine10 at histone H3 correlates with transcriptional activation of a subset of mammalian genes, including the HDAC1 gene. Further this particular modification frequently coincides with lysine acetylation on the same histone H3 tail, and the dual modification is frequently referred to as phosphoacetylation.
The aim of this thesis was to investigate the role of histone H3 phosphorylation/ phosphoacetylation during transcriptional activation and to examine whether multiple different modifications cooperate during this process.
14-3-3 proteins were identified as detector proteins for phosphorylated histone H3. In vitro interaction studies indicate that the weak interaction of 14-3-3 with serine10 phosphorylated histone H3 is susceptible to modulation via combinatorial modification patterns: phosphorylation is necessary for significant interaction but additional histone H3 lysine9 or lysine14 acetylation (phosphoacetylation) increases the affinity of 14-3-3 for the H3 tail. Besides acetylation, lysine9 is also methylated in transcriptional repressed chromatin. Mass spectrometry analysis reveals that phosphoacetylation coincides with lysine9 methylation in vivo. This triple modified histone H3 species is efficiently bound by 14-3-3 proteins in vitro, suggesting that histone phosphorylation and acetylation can cooperate to temporarily “fade out” transcriptional repressive lysine methylation whilst retaining epigenetic information. Chromatin immunoprecipitation experiments demonstrate the localization of 14-3-3 proteins to the HDAC1 promoter region in a histone H3 serine10 phosphorylation dependent manner. This recruitment is reinforced by additional histone acetylation and correlates with the dissociation of the transcriptional repressive module HP1γ. siRNA-mediated depletion of 14-3-3 proteins abolishes the transcriptional activation of HDAC1, suggesting that 14-3-3 proteins relay the phosphoacetylation signal to the transcriptional machinery. Together, the presented data indicate that 14-3-3 proteins are central mediators of histone H3 phosphoacetylation signals during transcriptional induction.
Keywords (eng)
chromatinhistone14-3-3histone codetranscription
Keywords (deu)
ChromatinHistone14-3-3Histone CodeTranskription
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1250833
rdau:P60550 (deu)
127 S.Ill., graph. Darst.
Number of pages
151
Association (deu)
Title (eng)
Investigation of a phospho-histone H3 based histone code during transcriptional activation
Parallel title (deu)
Untersuchung eines auf phospho-Histone H3 basierenden Histone Codes während der transkriptionellen Induktion
Author
Stefan Winter
Abstract (deu)
DNA liegt innerhalb des eukaryontischen Zellkerns in Form eines dynamischen Nukleoprotein-Komplexes vor, der als „Chromatin“ bezeichnet wird. Die elementare Untereinheit des Chromatinpolymers ist das Nukleosom, ein DNA-Protein-Komplex, welcher je zwei Kopien der vier Histone H2A, H2B, H3 und H4 beinhaltet.
Post-translationelle Modifikationen (PTM) der N-Termini von Histonen, wie zum Beispiel Methylierung, Azetylierung oder Phosphorylierung stellen zentrale Elemente in der Chromatin-Biologie dar. Entsprechend der „Histonecode“-Hypothese vermitteln PTM diese Funktion durch die Rekrutierung von modifikationsabhängigen Faktoren (Detektorproteinen), durch die schließlich die Chromatin-Architektur verändern.
Während der Interphase korreliert die Phosphorylierung von Serin10 an Histone H3 mit der Transkription einer spezifischen Gruppe von Genen, einschließlich des HDAC1-Gens. Außerdem trifft diese spezielle Modifikation häufig mit Azetylierung von Lysin9 oder 14 desselben Histon H3 Moleküls zusammen, weswegen diese Doppel-Modifikation auch oft als „Phosphoazetylierung“ bezeichnet wird.
Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der Phosphorylierung/ Phosphoazetylierung von Histon H3 während der Transkription zu untersuchen und zu prüfen, ob mehrere unterschiedliche Modifikationen in diesem Prozess zusammenwirken.
14-3-3 Proteine wurden als „Detektor Proteine“ für phosphoryliertes Histon H3 identifiziert. Interaktionsmessungen in vitro zeigten, dass die schwache Interaktion zwischen 14-3-3 und Serin10 phosphoryliertem Histon H3 durch kombinatorische Modifikationsmuster moduliert wird: Serin10 Phosphorylierung ist für eine signifikante Interaktion notwendig, aber zusätzliche Azetylierung von Lysin9 oder Lysin14 erhöht die Affinität von 14-3-3 für Histon H3. Lysin9 wird neben Azetylierung auch in transkriptionell unterdrücktem Chromatin methyliert. Massenspektroskopische Studien zeigen, dass Phosphoacetylierung mit Lysine9 Methylierung in vivo zusammentrifft. Diese dreifach modifizierte Spezies wird in vitro effizient durch 14-3-3 gebunden. Dies lässt den Schluß zu, dass Histone Phosphorylierung und Azetylierung kooperieren, um temporär die reprimierende Lysine9 Methylierung „auszublenden“, während die epigenetische Information dieser Modifikation erhalten bleibt. Chromatinimmunopräzipitations-Experimente zeigen, dass die Lokalisierung von 14-3-3 Proteinen am HDAC1 Promoter abhängig von Histone H3 Phosphorylierung ist. Diese Rekrutierung wird durch zusätzliche H3 Azetylierung verstärkt und korreliert mit der Dissoziation des transkriptionellen Repressors HP1γ. siRNA vermittelte Abreicherung von 14-3-3 Proteinen unterbindet die transkriptionelle Induktion von HDAC1, was darauf hindeutet, dass 14-3-3 Proteine das Phosphoazetylierungs-Signal an die Transkriptions-Maschinerie weiterleiten. Zusammenfassend zeigen die präsentierten Daten, dass 14-3-3 Proteine zentrale Mediatoren des H3 Phosphoazetylierungs-Signals während der transkriptionellen Induktion sind.
Abstract (eng)
Within eukaryotic nucleus, DNA is organized into a structural dynamic nucleoprotein complex designated “chromatin”. The fundamental subunit of the chromatin polymer is constituted by the nucleosome, an octameric protein-DNA complex composed of four different histone species, histone H2A, H2B, H3 and H4.
Posttranslational modifications (PTM) of histone amino-terminal tails such as methylation, phosphorylation or acetylation are pivotal elements in chromatin biology. According to the “histone code” hypothesis, PTMs exert their function via the recruitment of modification dependent binding factors (detector proteins) that finally modulate chromatin architecture.
In interphase phosphorylation of serine10 at histone H3 correlates with transcriptional activation of a subset of mammalian genes, including the HDAC1 gene. Further this particular modification frequently coincides with lysine acetylation on the same histone H3 tail, and the dual modification is frequently referred to as phosphoacetylation.
The aim of this thesis was to investigate the role of histone H3 phosphorylation/ phosphoacetylation during transcriptional activation and to examine whether multiple different modifications cooperate during this process.
14-3-3 proteins were identified as detector proteins for phosphorylated histone H3. In vitro interaction studies indicate that the weak interaction of 14-3-3 with serine10 phosphorylated histone H3 is susceptible to modulation via combinatorial modification patterns: phosphorylation is necessary for significant interaction but additional histone H3 lysine9 or lysine14 acetylation (phosphoacetylation) increases the affinity of 14-3-3 for the H3 tail. Besides acetylation, lysine9 is also methylated in transcriptional repressed chromatin. Mass spectrometry analysis reveals that phosphoacetylation coincides with lysine9 methylation in vivo. This triple modified histone H3 species is efficiently bound by 14-3-3 proteins in vitro, suggesting that histone phosphorylation and acetylation can cooperate to temporarily “fade out” transcriptional repressive lysine methylation whilst retaining epigenetic information. Chromatin immunoprecipitation experiments demonstrate the localization of 14-3-3 proteins to the HDAC1 promoter region in a histone H3 serine10 phosphorylation dependent manner. This recruitment is reinforced by additional histone acetylation and correlates with the dissociation of the transcriptional repressive module HP1γ. siRNA-mediated depletion of 14-3-3 proteins abolishes the transcriptional activation of HDAC1, suggesting that 14-3-3 proteins relay the phosphoacetylation signal to the transcriptional machinery. Together, the presented data indicate that 14-3-3 proteins are central mediators of histone H3 phosphoacetylation signals during transcriptional induction.
Keywords (eng)
chromatinhistone14-3-3histone codetranscription
Keywords (deu)
ChromatinHistone14-3-3Histone CodeTranskription
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1250834
Number of pages
151
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