Investigating the quaternary structure of the FMDV Leader protease

Jutta Steinberger

doi:10.25365/thesis.5262

You are here: University of Vienna PHAIDRA Detail o:1257864

Title (eng)

Investigating the quaternary structure of the FMDV Leader protease

Parallel title (deu)

Untersuchung der quaternären Struktur der MKSV Leader Protease

Author

Jutta Steinberger

Advisor

Timothy Skern

Assessor

Timothy Skern

Abstract (deu)

Das Maul-und Klauenseuchevirus (MKSV) stellt ein Mitglied der Picornavirus-Familie dar und ist ein kleines, nicht-umhülltes Virus mit einem einzelsträngigen RNA-Genom mit positiver Polarität. Das RNA-Genom wird direkt in ein Polyprotein translatiert, welches anschließend von viralen Proteasen prozessiert wird. Das erste Protein dieses Polyproteins ist die Leader-Protease, die in Abhängigkeit von der Translationsinitiation an zwei verschiedenen Startkodons in den beiden Formen Labpro und Lbpro vorkommen kann. Lbpro ist eine papain-ähnliche Cystein-Protease, die sich durch einen Schnitt zwischen dem eigenen C-Terminus und dem N-Terminus des nachfolgenden Proteins VP4 vom Polyprotein abspaltet. Lbpro ist eine sehr spezifische Protease, die nur zwei zelluläre Substrate schneidet, nämlich die beiden Homologe des eukaryotischen Initiationsfaktors 4G (eIF4G), eIF4GI and eIF4GII. eIF4G spielt eine wichtige Rolle bei der eukaryotischen Translationinitiation, da es als Gerüstprotein dient und dadurch die „gecappte“ mRNA und das Ribosom zusammenführt. Der Begriff „Host cell shut off“ beschreibt den Vorgang während einer MKSV Infektion, bei dem eIF4G von der Leader Protease geschnitten wird und dadurch die zelluläre cap-abhängige Translationsinitiation verhindert wird. Dabei bleibt die Translation der viralen RNA allerdings unbeeinträchtigt, da die Translation durch eine IRES (internal ribosome entry site) eingeleitet wird. Das letztendliche Ziel dieser Studie ist die Verhinderung der Selbst-Prozessierung von Lbpro. Infolgedessen würde Lbpro mit dem viralen Capsidprotein VP4 verbunden bleiben. Daher wäre VP4 nicht mehr in der Lage sich korrekt in die virale Capsidstruktur einzugliedern, weshalb die Bildung von lebensfähigen Viruspartikeln verhindert wäre. Die Selbstprozessierung von Lbpro kann entweder inter- oder intramolekular ablaufen; allerdings wurde gezeigt, dass die cis-Spaltungsreaktion bevorzugt wird. Aus diesem Grund stellt die intramolekulare Selbst-Prozessierung von Lbpro einen wichtigen Angriffspunkt für die Entwickung von antiviralen Medikamenten dar. Aufgrund dieser Fakten haben wir uns in dieser Arbeit darauf konzentriert die intramolekulare Selbst-Prozessierung von Lbpro auf molekularer Ebene zu untersuchen. Es wurde beobachtet, dass Lbpro durch Insertion des C-terminalen Fortsatzes in das aktive Zentrum des benachbarten Moleküls stabile Dimere in Lösung bildet. Daher haben wir versucht das Dimer durch zielgerichtete Mutagenese zu trennen um in der Lage zu sein die Selbst-Prozessierung in cis untersuchen zu können. Zwei Regionen der Protease wurden mutiert: die Grenzflächen-Region zwischen den dimeren Lbpro Molekülen und der CTE, der an das aktive Zentrum des benachbarten Moleküls bindet. Da angenommen wurde, dass Trp 105 und Thr 117 zu den intermolekularen Interaktionen in der Grenzflächen-Region zwischen dimeren Lbpro Molekülen beitragen, wurden diese Aminosäuren entweder durch Ala ersetzt um potenzielle anziehende Interaktionen zu entfernen oder durch Arg um eine Abstoßung hervorzurufen. Die Mutationen W105A, T117A, W105A T117A und W105R in 98 der Grenzflächen-Region konnten weder die enzymatische Aktivität von Lbpro beeinflussen, noch konnten sie die Bildung von Dimeren verhindern. Aufgrund dieser Tatsachen, scheinen die Aminosäuren Trp 105 und Thr 117 keinen maßgeblichen Beitrag zur Dimer-Stabilität zu leisten. Interessanterweise war eine einzelne Mutation der C-terminalen Aminosäure Leu 200 zu Phe ausreichend um das Dimer zu trennen. Obwohl das monomere Lbpro L200F eine verzögerte Selbst- Prozessierung aufweist, konnte eine transiente Binding des CTE an das aktive Zentrum festgestellt werden. Daher liefern diese Untersuchungen interessante Einblicke im Bezug auf die intramolekulare Selbst-Prozessierung. Die Daten zeigen, dass die letzten sieben Aminosäuren des CTE in einer ähnlichen Weise an das aktive Zentrum gebunden sind wie es im Dimer der Fall ist. Allerdings, war es nicht möglich Signale für die letzten 12 Aminosäuren des CTE zu detektieren. Dies wird wahrscheinlich durch die Frequenz der transienten Interaktion zwischen CTE und aktivem Zentrum bedingt, die mit Kernresonanzspektrometrie schwierig zu detektieren ist. Die zusätzliche Mutation L143A stellt die Aktivität in der Selbst-Prozessierung wie auch die dimere Struktur von Lbpro L200F wieder her, obwohl das Lbpro L143A L200F Dimer destabilisiert erscheint. Weitere Untersuchungen betrafen die nukleäre Lokalisation von Lbpro. Es wurde angenommen, dass Lbpro durch rezeptor-vermittelten Transport in den Zellkern eindringt. Aus diesem Grund wurde enzymatisch inaktives Lbpro in humanen Zellen exprimiert. Allerdings war es nicht möglich Lbpro in nennenswerten Mengen im Zellkern nachzuweisen. Aufgrund dieser Ergebnisse, konnte eine nukleäre Lokalisation und ein rezeptor-vermittelter Transport von Lbpro in den Zellkern nicht bestätigt werden.

Abstract (eng)

Foot-and-mouth disease virus (FMDV), being a member of the picornavirus family, is a small, non-enveloped virus with a single-stranded RNA genome of positive polarity. The RNA genome is directly translated into a long polyprotein which is subsequently processed by viral proteases. The first protein encoded on this polyprotein is the Leader protease that can exist in two different forms, Labpro and Lbpro, dependent on the translation initiation at two different start codons. Lbpro is a papain-like cysteine protease that frees itself from the polyprotein by cleavage between its own C-terminus and the N-terminus of the subsequent protein VP4. Lbpro is a very specific protease cleaving only two cellular substrates, the two homologues of the eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G), eIF4GI and eIF4GII. eIF4G plays an important role in eukaryotic translation initiation as it acts as a scaffold protein that brinds together the capped mRNA and the ribosome. The term ‚host cell shut off’ describes the process during FMDV infection, at which eIF4G is cleaved by the Leader protease resulting in the inhibition of cellular capdependent translation initiation. However, the translation of the viral RNA remains unaffected as translation is initiated via an IRES (internal ribosome entry site). The overall goal of this study is to inhibit the Lbpro self-processing step. Consequently, Lbpro would remain connected with the capsid protein VP4. As a result, VP4 would not be able to fit correctly into the viral capsid structure, thus inhibiting the formation of viable virus particles. Lbpro self-processing can occur either inter- or intramolecularly; however, the cis cleavage reaction was shown to be preferred. Therefore, intramolecular self-processing of Lbpro is an important target for the development of anti-virals. Due to these facts, in this work we focused on the investigation of the intramolecular selfprocessing reaction of Lbpro at the molecular level. It was observed that Lbpro forms stable dimers in solution by inserting the C-terminal extension (CTE) of one molecule into the active site of the neighbouring molecule. Therefore, we tried to separate the dimer by site-directed mutagenesis in order to be able to investigate self-processing in cis. Mutations were introduced at two regions of the protease: the interface region between dimeric Lbpro molecules and the CTE which binds to the active site of the neighbouring molecule. As Trp 105 and Thr 117 were thought to contribute to the intermolecular interactions in the interface region between dimeric Lbpro molecules, these residues were substituted either by Ala to remove potential attractive interactions or by Arg to provoke repulsion. However, the mutations W105A, T117A, W105A T117A and W105R in the interface region neither affected the enzymatic activity of Lbpro nor could they inhibit dimer formation. Therefore, residues Trp 105 and Thr 117 do not appear to make crucial contributions to the stability of the dimer. Interestingly, the single mutation of the C-terminal residue Leu 200 to Phe was sufficient to disrupt the dimer. Although monomeric Lbpro L200F appeared delayed in self-processing, a transient binding of the CTE to the active site could be determined. Therefore, these findings 96 provide interesting insights concerning intramolecular self-processing. The data indicate that the last seven amino acids of the CTE are bound to the active site in a similar way as present in the dimer. However, it was not possible to detect signals for the last 12 residues of the CTE. This is probably caused by the rate of transient interaction between the CTE and the active site, which is difficult to detect by NMR. The additional mutation L143A restores the self-processing activity as well as the dimeric structure of Lbpro L200F, although the Lbpro L143A L200F dimer appears rather destabilised. Further investigations concerned the nuclear localisation of Lbpro. It was considered that Lbpro enters the nucleus via receptor-mediated transport. Therefore, enzymatically inactive Lbpro was expressed in human cells. However, it was not possible to detect Lbpro in the nucleus in appreciable amounts. Due to these findings, nuclear localisation and receptor-mediated nuclear transport of Lbpro into the nucleus could not be confirmed.

Keywords (eng)

PicornavirusesFoot-and-mouth disease virusleader proteasestructureNMR

Keywords (deu)

PicornavirenMaul-und-Klauenseuche VirusLeader ProteaseStrukturKernresonanzspektrometrie

Subject (deu)

Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines

Subject (deu)

Molekularbiologie

Subject (deu)

Biochemie: Sonstiges

Type (deu)

Diplomarbeit