Im ersten Teil der vorliegenden Diplomarbeit wird die Entwicklung einer neuen RNA Interferenz (RNAi) Anwendung, dem Triple-RNAi-Vector, beschrieben. Diese Technik erlaubt uns, zeitgleich bis zu drei Proteinexpressionen mittels RNAi zu verringern. Wir benutzten das MultiSite-GatewayTM System, um bis zu drei Kassetten, bestehend aus je einem humanen U6 Promoter und einem RNAi vermittelndem Oligonucleotid, in einem Expressionsvektor zu rekombinieren. Erste Test zeigten die effiziente Funktion des Triple-RNAi-Vektors an drei ektopisch exprimierten Reporter Enzymen in HEK 293 Zellen. Diese Technik ist konzipiert für funktionelle Proteinanalyse, speziell für funktionell redundante Proteine und für Proteine in parallelen Signalkaskaden. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der weiterführenden Charakterisierung des Kernproteins Lamina-assoziertes-Polypeptid 2 alpha (LAP2a). RNAi-Konstrukte gegen LAP2a, LAP2a, alle LAP2 Isoformen, A-Typ Lamine, Emerin und BAF wurden in transienten Transfektionsexperimenten getestet. Funktionelle RNAi-Konstrukte gegen LAP2a und alle LAP2 Isoformen nutzten wir um stabil transfektierte Zellpools herzustellen. Zur Charakterisierung wurden Einzelzellklone mit stark reduzierten LAP2a Proteinniveaus in HEK und HeLa Zellen selektiert. Die HeLa Einzelzellklone zeigten stark erhöhte Zellteilungsraten verglichen mit den Kontrollzellinien, dieser Effekt war unter Serumreduktion noch stärker ausgeprägt. Im Gegensatz dazu zeigten HEK Zellen mit reduziertem LAP2a Proteinniveau keinen Wachstumseffekt. Da HEK Zellen kein korrekt prozessiertes Lamin A exprimieren ist dies ein weiterer Hinweis auf die Zellzyklus regulierende Funktion dieser Bindungspartner. Im Rahmen von Co-Lokalisationsstudien mittels Immunfluoreszenzen wurde gezeigt, daß ein geringes Proteinniveau von LAP2a, keinen Einfluß auf dessen eigene, noch auf die zelluläre Lokalisation von Lamin A, oder die von LAP2a hat. Des weiteren blieb die Integrität des Zellkerns trotz LAP2a RNAi erhalten. Zusammenfassend konnten wir eine zellzyklusregulierende Funktion von LAP2a durch dessen RNAi vermittelte Reduktion zeigen.

In the first part of the thesis a new Triple RNA interference (RNAi) vector system was established. We developed an RNAi technique to simultaneously target up to three genes. For stable silencing, the MultiSite-GatewayTM system was used to shuttle up to three different cassettes, each consisting of a human U6 promoter and an oligonucleotide encoding a short hairpin RNA (shRNA), into one destination vector. The system was shown to work efficiently on three ectopically expressed proteins. Thus, this tool is applicable for analyzing proteins with redundant functions and protein hierarchies within signal transduction pathways. In the second part of the thesis, we further analyzed the in vivo function of lamina-associated polypeptide 2 alpha (LAP2a) and related proteins by RNAi. For transient and/or stable RNAi, we designed hairpin constructs targeting LAP2a, LAP2ß, all LAP2 isoforms, A-type lamins, emerin and BAF. We were able to transiently reduce the expression of LAP2a and all LAP2 isoforms, and created pools of cells stably expressing these functional shRNAs. Single cell clones, strongly down regulating LAP2a, were selected and their phenotype analyzed. LAP2a deficient HeLa cells showed increased cell proliferation rates and did not respond to serum starvation, like cells transfected with control plasmids. In contrast, HEK cells, which do not correctly process pre-lamin A, did not show any proliferation effect, underscoring the necessity of lamin A for the cell cycle control pathway. Co-localization studies by immunofluorescence indicate, that lamin A and LAP2ß localization as well as the overall integrity of the nuclear envelope was not compromised upon downregulation of LAP2a. In summary, RNAi mediated downregulation of LAP2a revealed a role of LAP2a on cell proliferation.