Characterization of the DNA methyltransferase M.NmaphiCh1I and  further characterization of a transformation system  of haloalkaliphilic Archaea

Flora Haider

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Title (eng)

Characterization of the DNA methyltransferase M.NmaphiCh1I and further characterization of a transformation system of haloalkaliphilic Archaea

Parallel title (deu)

Charakterisierung der DNA Methyltransferase M.NmaphiCh1I und weitere Charakterisierung eines Transformationssystems haloalkalophiler Archaea

Author

Flora Haider

Advisor

Angela Witte

Assessor

Angela Witte

Abstract (deu)

Diese Arbeit beschreibt den Versuch der Charakterisierung der M.NmaphiCh1 und der weiteren Charakterisierung eines entwickelten Transformationssystems in haloalkaliphilien Archaea. Der Virus aus dem das Methyltransferasegen isoliert wurde ist ein temperenter Phage, dessen einzig bekannter Wirt Nab. magadii ist. Die optimalen Lebensbedingungen dieses Archaeons sind hohe Salzkonzentrationen und extrem hohe pH Werte. Es wurden drei Konstrukte die entweder das ganze Methyltransferasegen oder Teile davon enthalten durch PCR angefertigt und in verschiedene Vektoren kloniert, nämlich pro-5, pQE32 und pRSET-C. Die drei Vektoren, die entweder das gesamte Mtase-Gen oder Teile davon enthielten, wurden benutzt, um die Transformationseffiezienz in Nab. magadii L13 zu prüfen. Allerdings mußte dafür zuerst die Promotorsequenz vom ORF34 davor kloniert weden, da bis dato der vermeintliche Initiationsstartpunkt der Mtase nicht bekannt war. Die pQE32 Konstrukte wurden verwendet um in vivo die Aktivität auf ihre Existenz zu prüfen. Zuletzt wurde anhand der pRSET-C Vektoren, die ebenfalls die Mtasefragmente enthielten die Bindung des Proteins an verschiedene unmethylierte DNA Sequenzen getestet. Dabei hat sich z.B. herausgestellt, dass für die erfolgreiche Bindung Chelat bindende Substanzen wie EDTA notwendig sind. Der zweite Teil dieser Arbeit hat sich mit dem Transformationssystem und dessen weitere Charakterisierung beschäftigt. Zu Beginn wurde versucht heraus zu finden welches Enzym eine bessere Spheroplastenbildung hervorruft, Proteinase K oder Pronase E. Dabei hat sich heraus gestellt, dass durch den Gebrauch von Proteinase K mehr Spheroplasten gebildet werden, nur im Falle von Nmn. pharaonis kann auf den Gebrauch von Pronase E nicht verzichtet werden. Verschiedene Plasmide sogar mit unterschiedlichen Antibiotikaresistenzen wurden versucht zu transformieren. Diese Versuche zeigten dass es möglich ist Mevinolin als Selektionsmarker zu verwenden. Die optimalen Wachstumsbedingungen waren in diesem Fall 7.5 µg/ml Mevinolin. Anhand dieser Ergebnisse wurden folgende Vektoren erfolgreich in Nab. magadii L13 transformiert: pRo-5, pRo-4, pro-4/Mev, pNB102 und zwei neu konstruierte, pNov-1/101 und pRo-5/Bop. Obwohl pNov-1/101 den gleichen Replikationsursprung wie pNB102 enthält wurde es effiezienter von den Zellen aufgenommen als pNB102. Plasmide wie pMDS11 und pMDS24 konnten leider nicht transformiert werden. Auch andere Organismen, nämlich Nmn. pharaonis wurden auch bezüglich ihrer Transformationsfähigkeit untersucht. Die oben genannten Plasmide wurden auch hier erfolgreich transformiert, allerdings mit einer geringeren Ausbeute. Zusätzlich wurden auch die Vektoren pMG100, pMG200 und pMG300 in die Testreihe miteinbezogen, deren Transformanten mit Southern blot Analysen bestätigt wurden.

Abstract (eng)

This thesis describes the analysis for the characterization of the M.NmaphiCh1 and further characterization of a transformation system in haloalkaliphilic Archaea. The virus from which the methyltransferase gene was isolated is a temerate one and its only known host is the archaeon Nab. magadii, whose optimal living conditions are in a high alkaine environment with high pH values. Three constructs including the whole or parts of the mtase gene were performed by PCR and cloning into different plasmids like pRo-5, pQE32 and pRSET-C. pRo-5 plasmids including the different fragments of the Mtase gene were used for transformation experiments in Nab. magadii L13 to test the efficiencv. Therefore, it was needed to clone the promotorsequence of ORF34 infront of the fragments because till this thesis it putative initiation sequence was not known. The pQE32 constructs were used for in vivo assays to determine the activity of the gene. Binding assays with different unmethylated DNA substrates were performed with the pRSET-C constructs, which result in the assumption that a chelat binding agent like EDTA is required for binding of the protein. The second part of this study is the further characterization of the established trans-formation system in Archaea. Therefore it was tested what kind of enzyme is better for forming spheroplasts, proteinase K or pronase E. It became apparent that proteinase K is the more efficient enzyme. Only in case of Nmn. pharaonis the pronase E was needed to successed in transformation. Different plasmids even with an other antibiotic resistance were tried to transform, which lead to the possibility to use mevinolin as a marker gene. Growth experiments and a few transformations showed that the optimal concentration of mevinolin is 7.5 µl/ml. With these data plasmids like pRo-5, pRo-4, pro-4/Mev, pNB102 and two constructed ones pNov-1/101 and pRo-5/Bop were successfully transformed into Nab. magadii L13. pNov-1/101 which containes the same origin of replication as pNB102 was anyhow more efficient. Plasmids like pMDS11 and pMDS24 were not transformable. Other organisms were also tested namely Nmn. pharaonis. The same plasmids were indeed with a lower efficiency but successfully transformed and additionally the con-structs pMG100, pMG200 and pMG300 which were proven by Southern blot analysis.

Keywords (eng)

haloalkaliphilic ArchaeaNab. magadiiphiCh1, HalovirusDNA methyltransferaseM.NmaphiCh1INmn. pharaonisTransformation system

Keywords (deu)

Haloalkaliphile ArchaeaNab. magadiiphiCh1HalovirusDNA MethyltransferaseM.NmaphiCh1INmn. pharaonisTransformationssystem

Subject (deu)

Subject (deu)

Subject (deu)

Type (deu)