Receptor specificity and cellular entry of human rhinoviruses

Abdul Ghafoor Khan

doi:10.25365/thesis.5916

You are here: University of Vienna PHAIDRA Detail o:1259097

Title (eng)

Receptor specificity and cellular entry of human rhinoviruses

Author

Abdul Ghafoor Khan

Advisor

Dieter Blaas

Assessor

Varpu Marjomäki

Renate Fuchs

Abstract (deu)

Humane Rhinoviren (HRVs) stellen die Hauptursache für grippale Infekte dar. Zurzeit kursieren mehr als 100 Serotypen, welche aufgrund von Rezeptorspezifität in zwei Gruppen unterteilt werden. Minor group HRVs erkennen Vertreter der „low-density lipoprotein receptor“ (LDLR) Familie, major group Rhinoviren binden an „intercellular adhesion molecule“ 1 (ICAM-1). Die Analyse von Rezeptorunterscheidung auf atomarem Level zeigte, dass major group HRVs eine ICAM-1- Erkennungssignatur aufweisen, die in minor group HRVs nicht aufscheint. Bei minor group HRVs ist ein Lysin streng konserviert, es kommt im HI loop vonVP1 von allen Vertretern der minor group vor. Mit hoher Wahrscheinlichkeit nimmt es eine Schlüsselrolle bei der Erkennung von LDL- Rezeptoren ein. Interessanterweise kommt dieses Lysin auch bei HRVs vor, die an ICAM-1 binden; diese werden K-Typ Viren genannt. Während der Charakterisierung der Rezeptorspezifität von K-Typ Viren fanden wir heraus, dass HRV8 und HRV18 mit VLDLR- Konkatemeren interagieren können. Im Vergleich zu HRV2 ist diese Interaktion allerdings viel schwächer, des Weiteren sind K-Typ Viren nicht in der Lage an membranständige oder von Zellen präsentierte LDL- Rezeptoren zu binden. Während der Überprüfung ob K-Typ Viren ICAM-1 defiziente Rhabdomyosarcomazellen (RD) infizieren können, fiel auf, dass HRV54 in der Lage ist in diesen Zellen zu replizieren. Infection inhibition assays gaben einen Hinweis darauf, dass Heparansulfat-(HS) in die Zellerkennung durch HRV54 involviert sein könnte. Mithilfe von Rezeptorblockade, Inhibierung der Sulfatierung, enzymatischem Verdau und Verwendung von HS- defizienten Zelllinien zeigen wir, dass HRV54 Wildtyp (wt), ohne jegliche Adaptierung, HS als alternativen Rezeptor nutzen kann. Infektion via HS ist allerdings im Vergleich zu Infektion via ICAM-1 weniger effizient, vermutlich aufgrund von schlechterer Virusaufnahme in die Zelle und Freisetzung des viralen Genoms. HRV54 ähnelt HRV2 bezüglich Säurelabilität. In ICAM-1- exprimierenden Zellen kann HRV54 auch in Gegenwart des H+-ATPase- Inhibitors Bafilomycin A1 replizieren. In Zellen, die ICAM-1 nicht exprimieren wird die Replikation von HRV54 durch Bafilomycin komplett blockiert. Folglich nötigt der Gebrauch eines nicht katalytisch wirkenden Rezeptors das Virus zu erhöhter Säurelabilität. 4 Dieser Bedarf an erhöhter Säurelabilität wurde auch bei HRV8, einem weiteren K-Typ Virus Vertreter festgestellt. HRV8 kann ebenfalls mittels HS an RD Zellen binden und aufgenommen werden, löst allerdings keine Infektion aus da das virale Genom nicht freigesetzt wird. Nach einigen Serienpassagen/ Blindpassagen wurde eine Variante (HRV8v) selektiert, die die Fähigkeit in RD Zellen zu replizieren gewonnen hatte. HRV8 und HRV8v unterscheiden sich stark bezüglich pH- Sensitivität, wobei HRV8 wt stabiler ist als HRV8v. Zusammengefasst weisen diese Beobachtungen darauf hin, dass ein allgemeiner Trend bei HRVs besteht an HS zu binden. Die Neigung an HS zu binden ist eng mit geringerer Säurestabilität verbunden, um eine Konformationsänderung des Capsids auch ohne die Hilfe des diesbezüglich katalytisch wirksamen Rezeptors ICAM-1 zu gewährleisten. Minor group HRVs werden durch Clathrin- abhängige Endozytose in die Zelle aufgenommen, für major group HRVs, und HRV- Serotypen, die an HS binden, ist der Mechanismus, durch den sie in die Zelle aufgenommen werden weitgehend unbekannt. Wir charakterisierten daher die Aufnahmemechanismen dieser Viren und der drei korrespondierenden Rezeptortypen. Mittels konvokaler Immunofluoreszenzmikroskopie konnte gezeigt werden, das Viren, je nachdem welcher Rezeptor benutzt wurde, in unterschiedliche Zellkompartimente transportiert wurden. Durch Kombination dieser Technik mit Elektronenmikroskopie, der Herstellung von dominant- negativen Mutanten, und der Austestung von pharmakologischen Inhibitoren konnten wir zeigen, dass HRV14, als Repräsentant der major group HRVs, mittels Dynamin- unabhängiger Makropinozytose in RD-ICAM Zellen aufgenommen wird und sich an tubulären Zellmembraninvaginationen ansammelt. Aufnahme von HRV8 in RD Zellen, vermittelt durch HS zeigt ähnliche Charakteristika bezüglich der Kolokalisation mit Endozytosemarkern und den inhibitorischen Effekten von pharmakologisch aktiven Substanzen. Die Aufnahme HRV8 ist aber im Gegensatz zum Zelleintritt von HRV14 abhängig von funktionellem Dynamin, des Weiteren wird HRV8 in vergleichsweise größeren vesikulären Strukturen konzentriert. Das unterschiedliche Rezeptorbindungsverhalten und die verschiedenen Invaginationsstrukturen bei der Aufnahme von HRV14 und HRV8 demonstrieren die Existenz von sowohl Dynamin- abhängiger als auch – unabhängiger Makropinozytose in RD Zellen.

Abstract (eng)

Human rhinoviruses (HRVs), the major cause of the common cold, are characterized by more than 100 circulating types and are classified into two groups on the basis of receptor specificity. Minor group HRVs use members of the low-density lipoprotein receptor (LDLR) super-family while major group types bind to intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1). Analysing receptor discrimination at the atomic level, it has been shown that major group viruses contain ICAM-1 recognition signatures which are absent in the minor group HRVs. On the other hand, a single lysine residue is strictly conserved in the HI loop of VP1 of all minor group HRVs and is thought to play a key role in docking of the virus to LDL receptors. Interestingly, this lysine is also present in some ICAM-1 binding HRVs called K-type viruses. While characterizing the receptor specificity of the K-type HRVs, we found that HRV8 and HRV18 can interact with VLDLR concatemers. However, this interaction is much weaker when compared to HRV2 and they neither bind to LDLR immobilized on membranes nor on the cell surface. While screening these K-type HRVs for their ability to infect ICAM-1 negative rhabdomyosarcoma (RD) cells, we noticed that HRV54 is able to replicate in these cells. Infection inhibition assays indicated the involvement of heparan sulfate (HS) proteoglycans. By using receptor blocking assays, inhibition of sulfation, enzymatic digestion, and proteoglycan deficient cell lines, we show that wild type HRV54, without any adaptation, uses HS as an alternate receptor. However, infection via HS is less efficient than infection via ICAM-1 most probably due to inefficient virus entry and uncoating. HRV54 has a similar acid lability profile as HRV2 and in ICAM-1-expressing cells it can replicate in the presence of the H+-ATPase inhibitor bafilomycin A1 whereas in ICAM-1 deficient cells its replication is completely blocked by the drug. Thus, using a non-catalytic receptor requires the virus to be highly sensitive to low pH. Moreover, the requirement for low pH sensitivity was also found in HRV8, another K-type virus that can bind and enter into RD cells via HS but fails to infect due to lack of uncoating. However, a variant (HRV8v) selected after few blind passages acquired the ability to replicate in these cells. It turned out that both viruses significantly differ in pH sensitivity, HRV8 wt being more stable than HRV8v. Collectively, these findings pinpoint a general trend in HRVs for binding to HS; this is intimately linked with becoming less stable to allow uncoating in the absence of catalytic receptor ICAM-1. 2 Where minor group HRVs depend on clathrin-mediated endocytosis, the pathway of major group HRVs and that of HS-binding viruses is largely unknown. We thus characterized the entry pathway(s) of these viruses when infecting the host cell via either of the three receptors. Immunofluorescence confocal microscopy demonstrated that the viruses were localized to different compartments within the infected cells depending on the type of receptor used for binding. Combining this technique with electron microscopy, dominant negative mutants and pharmacological inhibitor assays, we demonstrate that the major group virus HRV14 enters via dynamin-independent macropinocytosis into RD-ICAM cells where many viruses accumulate in long tubular structures. Entry of HRV8 into RD cells via HS exhibits similar characteristics with respect to co-localization with endocytic markers and pharmacological inhibitor profiles. However, HRV8 entry is dependent on functional dynamin and viruses accumulate in comparatively larger vesicular structures. The behaviour of HRV14 and HRV8, binding to quite different receptor molecules demonstrate the existence of both dynamin-dependent and dynamin-independent macropinocytosis in RD cells

Keywords (eng)

human rhinovirusesreceptorentry pathways

Keywords (deu)

humane SchnupfenvirenRezeptorenTransportwege

Subject (deu)

Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines

Type (deu)

Dissertation

Persistent identifier

https://phaidra.univie.ac.at/o:1259097

DOI

10.25365/thesis.5916