Title (eng)
Identification of regulatory phosphorylation sites on the human kinetochore
Parallel title (deu)
Identifizierung von Regulatorischen Phosphorylierungsstellen am Humanen Kinetochor
Author
Stephan Zettl
Advisor
Jan-Michael Peters
Assessor
Jan-Michael Peters
Abstract (deu)
Ein grundlegendes Merkmal der Mitose ist die exakte Aufteilung des genetischen Materials auf die Tochterzellen. Ausschlaggebend für diesen Prozess ist die Aufteilung der Schwesterchromatiden zu jeweils entgegengesetzten Zellpolen durch die Mitotische Spindel. Die Anheftung der Spindel-Mirotubuli erfolgt über Kinetochore, proteinöse Strukturen die sich an den Zentromeren der Chromosomesn befinden. Kinetochore sind dynamische Strukturen, die sensibel auf Mikrotubuli-Anheftung, Zugspannung sowie auf die Signalübertragung des „Spindle Assembly Checkpoint“ (SAC) reagieren, sie spielen daher eine außerordentlich wichtige Rolle bei der Ausbildung der Metaphase Spindeln sowie der Teilung der Schwester-Chromatiden in der Anaphase. Kinetochore bestehen aus vielen Proteinkomplexen, deren molekulare Charakterisierung gerade andauert. Zu den bereits näher charakterisierten Kinetochor-Proteinkomplexen gehören unter anderem die Komplexe Mis12, Hec1 und RZZ, von denen man annimmt, dass sie die Generierung und Aufrechterhaltung der Zugspannung sowie die Rekrutierung von Spindel Checkpoint Komponenten an die Kinetochore regulieren. Weiterhin ist bekannt, dass sich viele Kinasen, wie Cdk1, Aurora B, Plk1, Mps1 und BubR1 an den Kinetochoren befinden, was darauf hinweist, dass Kinetochor-Proteine potentiell wichtige Substrate für diese Kinasen darstellen. Mit dem Ziel, Komponenten und Phosphorylierungen dieser Proteinkomplexe in mitotischen humanen Zellen zu untersuchen, habe ich Antikörper gegen Kinetochor-Proteine hergestellt sowie HeLa Zellen generiert, die Kinetochor-Proteine mit Affinitäts-tags expremieren. Ein Affinitäts-tag erleichtert die Aufreinigung der Proteine und ermöglicht Massenspektrometrie Experimente durchzuführen. Von fünf generierten Antikörpern, zeigte sich einer (gegen die Mis12 Komponente DC8) als hoch spezifisch und effektiv für die Immunpräzipitation. Die Expression der getaggten Kinetochor-Komponenten war hingegen nicht ausreichend für die angedachten Affinitäts-Aufreinigungen. Mittels des generierten anti-DC8 Antikörpers, reinigte ich viele der bekannte Mis12 Komponenten, den kompletten Hec1 Komplex, weitere mitotische Spindel-Proteine (wie HP1-gamma, SPAG5 und dynein light chain) sowie einige neue Interaktionspartner (wie C15orf23, RABGAP1 und claspin) aus mitotischen sowie Interphase HeLa Zellextrakten auf. Durch weitere Analyse dieser aufgereinigten Proteinkomplexe identifizierte ich insgesamt 44 Phosphorylierungsstellen in sechs der Proteine, DC8, Q9H410, C15orf23, PFKFB2, RABGAP1 and SPAG5. Beim Vergleich der Phosphorylierungs-Muster dieser Proteine aus Interphase und Mitose, wurden 18 Mitose-spezifische Stellen gefunden. Die Identifizierung von Phosphorylierungsstellen leistet einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der dynamischen Steuerung der Kinetochore in der Mitose.
Abstract (eng)
A vital feature of mitosis is the accurate segregation of genetic material to the daughter cells. This process crucially depends on biorientation of the sister chromatids on the mitotic spindle. The attachment of spindle microtubules to the mitotic chromosomes occurs via kinetochores, proteinaceous structures which form on the centromeres. Kinetochores are dynamic structures capable of sensing microtubule attachment and tension as well as signaling to the spindle assembly checkpoint (SAC) and therefore are critically involved in formation of the metaphase spindle and the segregation of sister chromatids in anaphase. Kinetochores are known to be made of many protein complexes which are still being characterised. Among those characterised so far, are the Mis12, Hec1 and RZZ complexes, which are thought to regulate the assembly and the maintenance of tension and recruitment of spindle checkpoint components to the kinetochore. The kinetochore is the location for several mitotic kinases, including Cdk1, Aurora B, Plk1, Mps1 and BubR1, and therefore kinetochore proteins would be prime candidates as substrates for these kinases. With the aim of investigating the components and phosphorylation of these complexes in mitotic human cells, I raised antibodies against kinetochore proteins and generated HeLa cells expressing affinity tagged kinetochore components to perform affinity purification and mass spectrometry experiments. Of the five antibodies, one of them (against the Mis12 component DC8) was found to be highly specific and effective for immuno-precipitation. By contrast, the expression of tagged kinetochore components was not sufficient for affinity purification purposes. The total set of proteins immuno-purified from HeLa extracts using the anti-DC8 antibody was found to contain many known Mis12 components plus the complete Hec1 tetrameric complex, additional mitotic spindle proteins (including HP1-gamma, SPAG5 and dynein light chain) and several novel interactors (including C15orf23, RABGAP1 and claspin). Phosphorylation site analysis identified 44 sites in six of these proteins, DC8, Q9H410, C15orf23, PFKFB2, RABGAP1 and SPAG5, purified from extracts of HeLa in interphase and mitosis. By comparing the phosphorylation states of these proteins under those conditions 18 sites were found to be mitosis specific. Identification of these phospho-sites could help in understanding the dynamic regulation of kinetochores in mitosis.
Keywords (eng)
mitosisphosphorylation siteskinetochorekinaseSACMis12DC8Hec1RZZmass spectrometry
Keywords (deu)
MitosePhosphorylierungKinetochoreKinaseSACMis12DC8Hec1RZZMassenspektrometrie
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1260581
rdau:P60550 (deu)
100 S. : Ill., graph. Darst.
Number of pages
102
Association (deu)
Title (eng)
Identification of regulatory phosphorylation sites on the human kinetochore
Parallel title (deu)
Identifizierung von Regulatorischen Phosphorylierungsstellen am Humanen Kinetochor
Author
Stephan Zettl
Abstract (deu)
Ein grundlegendes Merkmal der Mitose ist die exakte Aufteilung des genetischen Materials auf die Tochterzellen. Ausschlaggebend für diesen Prozess ist die Aufteilung der Schwesterchromatiden zu jeweils entgegengesetzten Zellpolen durch die Mitotische Spindel. Die Anheftung der Spindel-Mirotubuli erfolgt über Kinetochore, proteinöse Strukturen die sich an den Zentromeren der Chromosomesn befinden. Kinetochore sind dynamische Strukturen, die sensibel auf Mikrotubuli-Anheftung, Zugspannung sowie auf die Signalübertragung des „Spindle Assembly Checkpoint“ (SAC) reagieren, sie spielen daher eine außerordentlich wichtige Rolle bei der Ausbildung der Metaphase Spindeln sowie der Teilung der Schwester-Chromatiden in der Anaphase. Kinetochore bestehen aus vielen Proteinkomplexen, deren molekulare Charakterisierung gerade andauert. Zu den bereits näher charakterisierten Kinetochor-Proteinkomplexen gehören unter anderem die Komplexe Mis12, Hec1 und RZZ, von denen man annimmt, dass sie die Generierung und Aufrechterhaltung der Zugspannung sowie die Rekrutierung von Spindel Checkpoint Komponenten an die Kinetochore regulieren. Weiterhin ist bekannt, dass sich viele Kinasen, wie Cdk1, Aurora B, Plk1, Mps1 und BubR1 an den Kinetochoren befinden, was darauf hinweist, dass Kinetochor-Proteine potentiell wichtige Substrate für diese Kinasen darstellen. Mit dem Ziel, Komponenten und Phosphorylierungen dieser Proteinkomplexe in mitotischen humanen Zellen zu untersuchen, habe ich Antikörper gegen Kinetochor-Proteine hergestellt sowie HeLa Zellen generiert, die Kinetochor-Proteine mit Affinitäts-tags expremieren. Ein Affinitäts-tag erleichtert die Aufreinigung der Proteine und ermöglicht Massenspektrometrie Experimente durchzuführen. Von fünf generierten Antikörpern, zeigte sich einer (gegen die Mis12 Komponente DC8) als hoch spezifisch und effektiv für die Immunpräzipitation. Die Expression der getaggten Kinetochor-Komponenten war hingegen nicht ausreichend für die angedachten Affinitäts-Aufreinigungen. Mittels des generierten anti-DC8 Antikörpers, reinigte ich viele der bekannte Mis12 Komponenten, den kompletten Hec1 Komplex, weitere mitotische Spindel-Proteine (wie HP1-gamma, SPAG5 und dynein light chain) sowie einige neue Interaktionspartner (wie C15orf23, RABGAP1 und claspin) aus mitotischen sowie Interphase HeLa Zellextrakten auf. Durch weitere Analyse dieser aufgereinigten Proteinkomplexe identifizierte ich insgesamt 44 Phosphorylierungsstellen in sechs der Proteine, DC8, Q9H410, C15orf23, PFKFB2, RABGAP1 and SPAG5. Beim Vergleich der Phosphorylierungs-Muster dieser Proteine aus Interphase und Mitose, wurden 18 Mitose-spezifische Stellen gefunden. Die Identifizierung von Phosphorylierungsstellen leistet einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der dynamischen Steuerung der Kinetochore in der Mitose.
Abstract (eng)
A vital feature of mitosis is the accurate segregation of genetic material to the daughter cells. This process crucially depends on biorientation of the sister chromatids on the mitotic spindle. The attachment of spindle microtubules to the mitotic chromosomes occurs via kinetochores, proteinaceous structures which form on the centromeres. Kinetochores are dynamic structures capable of sensing microtubule attachment and tension as well as signaling to the spindle assembly checkpoint (SAC) and therefore are critically involved in formation of the metaphase spindle and the segregation of sister chromatids in anaphase. Kinetochores are known to be made of many protein complexes which are still being characterised. Among those characterised so far, are the Mis12, Hec1 and RZZ complexes, which are thought to regulate the assembly and the maintenance of tension and recruitment of spindle checkpoint components to the kinetochore. The kinetochore is the location for several mitotic kinases, including Cdk1, Aurora B, Plk1, Mps1 and BubR1, and therefore kinetochore proteins would be prime candidates as substrates for these kinases. With the aim of investigating the components and phosphorylation of these complexes in mitotic human cells, I raised antibodies against kinetochore proteins and generated HeLa cells expressing affinity tagged kinetochore components to perform affinity purification and mass spectrometry experiments. Of the five antibodies, one of them (against the Mis12 component DC8) was found to be highly specific and effective for immuno-precipitation. By contrast, the expression of tagged kinetochore components was not sufficient for affinity purification purposes. The total set of proteins immuno-purified from HeLa extracts using the anti-DC8 antibody was found to contain many known Mis12 components plus the complete Hec1 tetrameric complex, additional mitotic spindle proteins (including HP1-gamma, SPAG5 and dynein light chain) and several novel interactors (including C15orf23, RABGAP1 and claspin). Phosphorylation site analysis identified 44 sites in six of these proteins, DC8, Q9H410, C15orf23, PFKFB2, RABGAP1 and SPAG5, purified from extracts of HeLa in interphase and mitosis. By comparing the phosphorylation states of these proteins under those conditions 18 sites were found to be mitosis specific. Identification of these phospho-sites could help in understanding the dynamic regulation of kinetochores in mitosis.
Keywords (eng)
mitosisphosphorylation siteskinetochorekinaseSACMis12DC8Hec1RZZmass spectrometry
Keywords (deu)
MitosePhosphorylierungKinetochoreKinaseSACMis12DC8Hec1RZZMassenspektrometrie
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1260582
Number of pages
102
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