Allosterie stellt eine Möglichkeit dar Proteinfunktion und Aktivität zu regulieren. Seitenkettendynamik und strukturelle Konformationsänderungen sind zwei Möglichkeiten allosterische Regulationsmechanismen zu realisieren. In einem Protein, das allosterischer Regulation unterliegt, kann ein herankommendes Signal die Eigenschaften eben jenes Proteins verändern. Im Fall der KIX-Domäne des CREB-bindenden Proteins wird, nach Bindung des mixed lineage leukaemia (MLL) Transkriptionsfaktors, eine ≈2-fach gesteigerte Affinität zur phosphorylated kinase-inducible domain (pKID) gemessen. Nach heutigen Theorien wird die Kommunikation zwischen den beiden Bindungsstellen von KIX über ein dichtes Netz hydrophober Aminosäuren vermittelt. Dazu gehören die Isoleucine 611, 657 und 660, Phenylalanin 612 und Tyrosin 658. Die Interaktion zwischen KIX und MLL induziert eine globale Konformationsänderung hin zu einer Struktur die stärker an pKID bindet, ein sogenannter angeregter Zustand (excited state). Die Dynamik von Konformationsänderungen kann mittels NMR Relaxation gemessen werden. Es wurde die Dynamik einer Reihe an mutierten KIX Varianten analysiert um die Rolle der hydrophoben Aminosäuren in dem allosterischen Netzwerk zu überprüfen. Stark konservierte Aminosäuren die das allosterische Netzwerk bilden, wurden durch Ähnliche ausgetauscht um die Hypothese ihrer evolutionären Funktion zu verifizieren. NMR R2 Relaxation Dispersionsexperimente liefern quantitative Daten über den Beitrag chemischen Austauschs zur transversalen Relaxation. Laut unseren Daten ist das allosterische Netzwerk sehr sensitiv gegenüber den Austausch einzelner, hochkonservierter Aminosäuren. Mit Ausnahme der Y658V Mutante, ist die Dynamik aller mutierter KIX Varianten stark vermindert. Bindungsaffinitäten von KIX/pKID (K=4.11 μM) und KIX•MLL/pKID (K = 1.84 μM) wurden mittels isothermaler Titrationskalorimetrie (ITC) gemessen. Die bereits publizierten Ergebnisse von Goto et al., 2002 stimmen mit unseren überein: in-vitro zeigt der binäre KIX•MLL Komplex eine 2-fach höhere Affinität zu pKID als KIX alleine. Die nicht-komplexierte I660V Variante der KIX-Domäne zeigt eine leicht erhöhte Affinität zu pKID (K = 2.42 μM). Bindung des MLL Transkriptionsfaktor zeigt hier keine Erhöhung der pKID Bindungsaffinität. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die allosterische Regulation von KIX und die Konformationsänderungen hin zu einem angeregten Zustand in der I660V Mutante nicht mehr funktionieren. Um jedoch einen Zusammenhang zwischen Dynamik und Bindungsaffinität, sprich Allosterie, zu verifizieren, müssen auch die restlichen KIX Mutanten auf ihre pKID Bindungseigenschaften analysiert werden.

Allostery provides a way of regulating protein function and activity. Side chain dynamics and structural conformation shifts are the basis of allosteric regulatory mechanisms. In an allosteric protein an arriving signal changes its properties. In the case of the KIX-domain of the CREB-binding protein (CBP), a ≈2-fold increase in affinity to the phosphorylated kinase-inducible domain (pKID) upon binding of the mixed lineage leukaemia (MLL) transcription factor is observed. It is thought that communication between the two binding sites of KIX is mediated by a dense network of hydrophobic amino acids, including isoleucines 611, 657 and 660, phenylalanine 612 and tyrosine 658. Binding of MLL induces a global conformational switch to an excited state exhibiting a higher affinity to pKID. The dynamics of conformational rearrangements are amenable by NMR relaxation measurments. To verify their role in allostery, the dynamics of a series of mutant KIX forms were analysed. Highly conserved amino acids that form an essential part of the allosteric network were substituted for similar ones via site-directed mutagenesis in order to probe the importance of their proposed evolutionary function. NMR R2 relaxation dispersion experiments were used for quantitative determination of exchange contribution to transverse relaxation. Our data showed that the allosteric network is very sensitive to mutations. Dynamics of all mutants were strongly impaired when compared to wildtype KIX with the exception of KIX Y658V. Isothermal titration calorimetry was used for determining KIX/pKID (K = 4.11 μM) and KIX•MLL/pKID (K = 1.84 μM) binding affinities. We came to the same conclusion as Goto et al., 2002: in-vitro, the KIX•MLL complex displays a 2-fold higher affinity to pKID than free KIX. The free I660V mutant form shows a slightly increased affinity to pKID (K = 2.42 μM). Binding of the MLL transcription factor does not increase the pKID binding affinity. Allosteric signal transmission and conformational shifts to the excited state seem to be abolished. In order to verify a correlation between dynamics and binding affinity, residual KIX mutants have to be analysed with respect to pKID affinity.