In der mitotischen Zellteilung hängt die Segregation der Chromosomen von der Kohäsion der Schwesterchromatiden ab, die durch den Proteinkomplex Cohesin hergestellt wird. Die Chromosomenkohäsion ermöglicht die bipolare Orientierung der Chromosomen auf der mitotischen Spindel; doch sobald diese Anordnung der Chromosomen in der Metaphase erreicht wird, muss die Kohäsion gelöst werden, damit die Schwesterchromatiden in der Anaphase getrennt werden können. In den Zellen von Wirbeltieren wird der Großteil der Cohesinmoleküle bereits während der Prophase und der Prometaphase von den Chromosomenarmen entfernt. Dieser Mechanismus wird „Prophase Pathway“ der Cohesin-Dissoziation genannt und benötigt das Cohesin-assoziierte Protein Wapl. In der Metaphase, wenn alle Chromosomen bipolar an der Äquatorialplatte ausgerichtet sind, spaltet die Protease Separase die – besonders an den Zentromeren – verbliebenen Cohesinkomplexe und bewirkt dadurch die Segregation der Chromosomen. Die Spaltung von Cohesin durch Separase ist essentiell in der Mitose, da primäre Mausfibroblasten (pMEFs) ohne Separase Chromosomen nicht segregieren können.
Obwohl der „Prophase Pathway“ bereits seit vielen Jahren bekannt ist und untersucht wird, ist ungewiss, ob er für die Zellteilung essentiell oder mit Cohesin-Spaltung in der Anaphase durch Separase redundant ist. Um diese Frage zu beantworten und um die Funktionsweise des „Prophase Pathway“ besser zu verstehen, generierte ich eine konditionale „Knock-out“ Maus für Wapl. Wir machten die Entdeckung, dass die Deletion des Wapl-Gens bereits für den Embryo lethal ist. Dies deutet darauf hin, dass der „Prophase Pathway“ für die Entwicklung der Maus essentiell ist. In primären embryonalen Fibroblasten der Maus (pMEFs) ohne Wapl konnten wir beobachten, dass Schwesterchromatiden bis zur Metaphase ungewöhnlich eng miteinander assoziiert sind, in der Anaphase aber getrennt werden. Allerdings bemerkten wir in den meisten Zellen in der Anaphase zahlreiche Chromosomenbrücken, die in der Zytokinese unvollständige Zellteilung zur Folge haben. In pMEFs ohne Wapl bleibt Cohesin bis zur Metaphase mit den Chromosomenarmen assoziiert; in der Anaphase wird Cohesin aber von den Chromosomen entfernt. Dies weist darauf hin, dass Separase ausreicht, um alle Cohesinmoleküle zu spalten. Ich bestätigte diese Hypothese, indem ich pMEFs von Wapl-Separase Doppel-„Knock-out“-Mäusen analysierte: In diesen Zellen kann Cohesin überhaupt nicht von den Chromosomen entfernt werden, und sowohl Chromosomenarme als auch Zentromere bleiben eng miteinander verbunden. Um zu bestimmen, ob das Übermaß an Cohesinmolekülen – und nicht eine noch unbekannte, von Cohesin unabhängige Funktion von Wapl – die Chromosomenbrücken verursacht, verringerte ich die Menge an Cohesin in der Zelle durch RNA-Interferenz gegen Scc1 in Wapl „Knock-out“ Mäusen. Dies konnte die Segregationsdefekte mildern und deutet darauf hin, dass der Überschuss der Cohesinkomplexe der Grund für die beobachteten Abnormitäten ist. Deshalb vermute ich, dass der „Prophase Pathway“ der Cohesin-Dissoziation notwendig für die korrekte Chromosomensegregation in der Zellteilung von Säugern ist.
Zusätzlich bestimmte ich den Einfluss von Wapl auf das Fortschreiten des Zellzyklus in der Interphase: Ich etablierte ein Protokoll zur Inaktivierung von Wapl in G0-arretierten pMEF-Zellen und beobachtete, dass die Deletion von Wapl eine starke Hemmung der Zellproliferation verursacht. Unter diesen Bedingungen konnten nur wenige Zellen die Replikationsphase erreichen, viele verharrten aber in der G0/G1-Phase. Zwar ist die Ursache dieses Arrests noch nicht klar, jedoch konnte ich eine dramatische Zunahme an Chromatin-gebundenem Cohesin und an Cohesin-Bindestellen an der DNA feststellen. Das Muster der Cohesin-Lokalisation in Wapl „Knock-out“ Interphase-Zellen war auch verändert, verglichen mit Kontrollzellen. Die Cohesinmoleküle erscheinen als längliche Struktur, die mit der DNA co-lokalisiert. Diese Cohesinstruktur gleicht dünnen Fäden oder Würmern, weshalb ich diese Struktur vemicelli (das italienische Wort für kleine Würmer) taufte. Zusätzlich beobachtete ich eine sehr kompakte Interphase-Chromatinstruktur in Wapl „Knock-out“ pMEFs. Künftige Experimente sollen helfen, den Zusammenhang von Cohesin-vermicelli und veränderter Chromatinstruktur zu verstehen.

Chromosome segregation during mitosis depends on sister chromatid cohesion, which is mediated by the cohesin complex. Cohesion enables the biorientation of chromosomes on the mitotic spindle, but once biorientation has been achieved, cohesion has to be dissolved to allow the separation of sister chromatids in anaphase. In vertebrate cells, the majority of cohesin is removed from chromosome arms in prophase and prometaphase by a mechanism called the prophase pathway of cohesin dissociation. This pathway depends on a cohesin associated protein, called Wapl. When all chromosomes are bioriented on the metaphase plate, the protease separase cleaves the remaining cohesin complexes on chromosomes, in particular at centromeres, thus allowing chromosome segregation. Cohesin cleavage by separase is essential for mitosis because primary mouse embryonic fibroblasts (pMEFs) lacking Separase fail to segregate chromosomes.
Despite the fact that the prophase pathway has been studied for many years it remains unknown if this mechanism is essential for mitosis, or if the prophase pathway is simply redundant with the separase pathway. To address this question and to obtain insight into the functions of the prophase pathway I generated a Wapl conditional knockout (cko) mouse. I found that deletion of the Wapl gene causes embryonic lethality, suggesting that the prophase pathway is essential for viability. In pMEFs lacking Wapl we observed that sister chromatids remain abnormally tightly associated with each other until metaphase, but then can be separated in anaphase. However, in most anaphase cells numerous thick chromosome bridges are observed, resulting in incomplete cell division during cytokinesis. In pMEFs lacking Wapl cohesin remains associated with chromosome arms up until metaphase, but in anaphase cohesin is removed from chromosomes, suggesting that Separase is sufficient to remove the bulk of cohesin from chromosomes. I confirmed this notion by analyzing pMEFs from Wapl Separase double cko mice. In these cells, cohesin cannot be removed from chromosomes at all, and both chromosome arms and centromeres remain tightly associated with each other. To test if the excess of cohesin on mitotic chromosomes is the cause of the chromosome bridges I partially depleted cohesin by Scc1 RNA interference in Wapl knockout pMEFs. This resulted in a partial rescue of chromosome segregation defects suggesting that the persistence of cohesin on mitotic chromosomes is the cause of these abnormalities. I therefore conclude that the prophase pathway of cohesin dissociation is required for proper chromosome segregation during mammalian mitosis.
In addition, I characterized Wapl’s requirement for cell cycle progression in interphase. Inactivation of Wapl in pMEFs arrested in G0 phase strongly inhibited cell proliferation. Under these conditions, Wapl knockout cells rarely started S phase, suggesting that they are delayed or arrested in G0/G1 phase. Although the cause of this arrest is not yet clear, I found a dramatic increase of levels of chromatin-bound cohesin and of cohesin binding sites on DNA. The cohesin pattern in interphase Wapl knockout cells was also different then in control cells. Cohesin followed elongated structures that co-localized with DNA. These cohesin structures reminded me of thin worms and I therefore called them vermicelli (the Italian word for little worms). In addition I observed a more compacted interphase chromatin in Wapl knockout pMEFs. Future experiments will address the relationship between the cohesin vermicelli and chromatin structure.