Title (deu)
PCR-Amplifizierbarkeit von DNA aus Formalin fixierten Geweben
Author
Stefan Paireder
Advisor
Margit Cichna-Markl
Assessor
Margit Cichna-Markl
Abstract (deu)
Die Erforschung des menschlichen Genoms und seiner Funktion ist die Voraussetzung für zukünftige Studien im Bereich der Früherkennung und Heilung von genetischen Erkrankungen. Anatomische Präparatesammlungen, vor allem Feuchtpräparate, wie jene des pathologisch-anatomischen Bundesmuseums in Wien, stellen für diese Studien einen riesigen Pool an vor allem alter DNA dar. Voraussetzung dafür ist die erfolgreiche Extraktion intakter DNA aus solchen Präparaten.
Formaldehyd, das seit Beginn der Präparation als gängiges Fixiermittel einge-setzt wird, führt zur Bildung von Quervernetzungen innerhalb der DNA, was die Extrahierbarkeit der DNA erschwert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten Methoden entwickelt und optimiert werden, um DNA aus humanen Formalin fixierten Museumspräparaten in ausreichender Qualität und Menge zu extrahieren und ihre Amplifizierbarkeit mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) zu prüfen. Weiters sollte der Einfluss der Konservierungsmethode auf die Extrahierbarkeit und Amplifizierbarkeit der DNA untersucht werden. Da jedoch keine Informationen über die angewandten Methoden zur Konservierung der Museumspräparate verfügbar war, sollte auch DNA aus porzinen Geweben, welche unter definierten Bedingungen konserviert worden waren, extrahiert und deren Amplifizierbarkeit untersucht werden.
Zur Entwicklung der PCR-Methoden zur Amplifikation von porziner bzw. humaner DNA wurden anhand der Sequenz des Gens, welches das Protein Albumin codiert, Primer und eine Sonde entworfen. Bei der humanen DNA wurden Primer für ein 122 bp langes Amplikon als auch für ein 171 bp langes Amplikon ausgewählt. Alle Methoden wurden hinsichtlich Primer- und Sondenkonzentration sowie Annealingtemperatur optimiert. Die Effizienzen der TaqMan-Assays betrugen 86,1% für DNA aus nicht fixiertem porzinem Gewebe und 83,3% für DNA aus nicht fixiertem humanem Gewebe.
Um den Einfluss der Konservierungsmethode auf die Extrahierbarkeit der DNA untersuchen zu können, wurde ein Schweineherz mit drei Fixiermethoden (mit ungepufferter Formaldehydlösung mit gepufferter Formaldehydlösung und mit der historischen Kaiserlingmethode) fixiert. Zur DNA-Extraktion wurde eine in der Arbeitsgruppe entwickelte CTAB-Methode, verschiedene Varianten dieser Methode, eine in der Literatur empfohlene Hotalkaliextraktionsmethode sowie zwei kommerzielle DNA-Extraktionskits angewendet.
Als geeignete Extraktionsmethode erwies sich eine Variante der CTAB-Methode mit 1% SDS im Extraktionspuffer und anschließendem 72 h Verdau mit Proteinase K. Allerdings konnte mit dieser Methode nicht aus allen Museumspräparaten DNA extrahiert werden, wobei sich als Schlüsselparameter der erfolgreiche Verdau des Gewebes herauskristallisierte, dieser aber besonders bei den älteren Präparaten nicht erreicht wurde. Die besten Ergebnisse wurden mit einem speziell für FFPE Gewebe entwickelten kommerziellen Extraktionskit erzielt. Die Hotalkaliextraktion erwies sich allerdings nicht als erfolgreich.
Mit der PCR-Methode für porzine DNA konnte in allen untersuchten DNA-Extrakten das gewählte Templat amplifiziert werden. Die erhaltenen Ct-Werte waren von der Fixiermethode abhängig. Die ungepufferte Formaldehydlösung führte zu einer stärkeren Degradation der DNA als die gepufferte Fixierlösung und die Kaiserlingmethode.
Im Falle der humanen fixierten Proben konnte das 122 bp lange Templat in al-len untersuchten DNA-Extrakten amplifiziert werden, das 171 bp lange Templat hingegen nicht. Da bei den Museumspräparaten keine Information über die Fixiermethode vorlag, kann jedoch keine Aussage über den Einfluss der Fixiermethode auf die Degradation der DNA getroffen werden.
Abstract (eng)
Envisioning deep understanding and healing of congenital diseases serves as a strong driving force towards intensive research of the human genome, its structure and functions.
Collections of anatomical preparations constitute a large and interesting pool of old DNA for such research work. One such example is the pathological-anatomical museum in Vienna which owns a large collection of formalin fixed preparations. A prerequisite for gene studies is, however, the possibility to ex-tract intact DNA which can be amplified by PCR.
This diploma thesis describes the development and optimization of real-time PCR assays for the detection of human DNA from formalin fixed museum preparations. Furthermore the influence of the fixation method on DNA extraction and PCR amplification was investigated.
Since no information about the fixation methods of the museum preparations was available, porcine heart tissue was fixed by three different methods (with buffered formalin solution, with unbuffered formalin solution and by the historic Kaiserling method) under defined conditions. These samples were used to develop and optimize a real-time PCR assay for the detection of porcine DNA from formalin fixed tissue, to find out if the fixation method affects the extraction and amplification of DNA.
To develop the PCR methods, the gene sequence coding the protein albumin was chosen to design primers and the probe. In the case of the human DNA assay two different primers were designed, one for a 122 bp and one for a 171 bp template. The efficiencies of the optimized PCR methods for porcine and human DNA were found to be 86.1 and 83.3%, respectively.
For DNA extraction, the following methods were compared: an in house devel-oped CTAB protocol, different variants of the CTAB method, two commercial DNA extraction kits and a method recommended in literature, the so called hot alkali extraction.
The CTAB variant with 1% SDS in the extraction buffer and 72 h digest with proteinase K was found to be appropriate. However, this method did not allow extraction of DNA from all museum preparations. The key step was complete digestion of the tissue which could not be achieved in all cases. The most effi-cient extraction method was extraction with a commercial FFPE DNA extraction kit. With this kit, it was possible to extract DNA from each museum sample. The recommended hot alkali extraction method, on the other hand, did not result in satisfactory results with any of the museum samples.
In the case of porcine samples DNA could be amplified in all extracts from for-malin fixed tissues. However, the DNA quality depended on the fixation method. The lowest Ct-value and hence the best DNA quality was achieved with buffered formalin solution and the historic Kaiserling method, whereas unbuffered formalin solution led to poor DNA quality.
In the case of formalin fixed museum preparations, the shorter template but not the longer template was amplified in each tested DNA extract. Unfortunately there is no documentation about the exact fixation solution used and the history of the sample. Hence conclusions concerning the influence of the fixation method on DNA quality cannot be drawn.
Keywords (eng)
PCRDNA extractionformalin fixed Tissue
Keywords (deu)
PCRDNA-ExtraktionFormalin fixierte Gewebe
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1265468
rdau:P60550 (deu)
129 S. : graph. Darst.
Number of pages
137
Association (deu)
Title (deu)
PCR-Amplifizierbarkeit von DNA aus Formalin fixierten Geweben
Author
Stefan Paireder
Abstract (deu)
Die Erforschung des menschlichen Genoms und seiner Funktion ist die Voraussetzung für zukünftige Studien im Bereich der Früherkennung und Heilung von genetischen Erkrankungen. Anatomische Präparatesammlungen, vor allem Feuchtpräparate, wie jene des pathologisch-anatomischen Bundesmuseums in Wien, stellen für diese Studien einen riesigen Pool an vor allem alter DNA dar. Voraussetzung dafür ist die erfolgreiche Extraktion intakter DNA aus solchen Präparaten.
Formaldehyd, das seit Beginn der Präparation als gängiges Fixiermittel einge-setzt wird, führt zur Bildung von Quervernetzungen innerhalb der DNA, was die Extrahierbarkeit der DNA erschwert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten Methoden entwickelt und optimiert werden, um DNA aus humanen Formalin fixierten Museumspräparaten in ausreichender Qualität und Menge zu extrahieren und ihre Amplifizierbarkeit mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) zu prüfen. Weiters sollte der Einfluss der Konservierungsmethode auf die Extrahierbarkeit und Amplifizierbarkeit der DNA untersucht werden. Da jedoch keine Informationen über die angewandten Methoden zur Konservierung der Museumspräparate verfügbar war, sollte auch DNA aus porzinen Geweben, welche unter definierten Bedingungen konserviert worden waren, extrahiert und deren Amplifizierbarkeit untersucht werden.
Zur Entwicklung der PCR-Methoden zur Amplifikation von porziner bzw. humaner DNA wurden anhand der Sequenz des Gens, welches das Protein Albumin codiert, Primer und eine Sonde entworfen. Bei der humanen DNA wurden Primer für ein 122 bp langes Amplikon als auch für ein 171 bp langes Amplikon ausgewählt. Alle Methoden wurden hinsichtlich Primer- und Sondenkonzentration sowie Annealingtemperatur optimiert. Die Effizienzen der TaqMan-Assays betrugen 86,1% für DNA aus nicht fixiertem porzinem Gewebe und 83,3% für DNA aus nicht fixiertem humanem Gewebe.
Um den Einfluss der Konservierungsmethode auf die Extrahierbarkeit der DNA untersuchen zu können, wurde ein Schweineherz mit drei Fixiermethoden (mit ungepufferter Formaldehydlösung mit gepufferter Formaldehydlösung und mit der historischen Kaiserlingmethode) fixiert. Zur DNA-Extraktion wurde eine in der Arbeitsgruppe entwickelte CTAB-Methode, verschiedene Varianten dieser Methode, eine in der Literatur empfohlene Hotalkaliextraktionsmethode sowie zwei kommerzielle DNA-Extraktionskits angewendet.
Als geeignete Extraktionsmethode erwies sich eine Variante der CTAB-Methode mit 1% SDS im Extraktionspuffer und anschließendem 72 h Verdau mit Proteinase K. Allerdings konnte mit dieser Methode nicht aus allen Museumspräparaten DNA extrahiert werden, wobei sich als Schlüsselparameter der erfolgreiche Verdau des Gewebes herauskristallisierte, dieser aber besonders bei den älteren Präparaten nicht erreicht wurde. Die besten Ergebnisse wurden mit einem speziell für FFPE Gewebe entwickelten kommerziellen Extraktionskit erzielt. Die Hotalkaliextraktion erwies sich allerdings nicht als erfolgreich.
Mit der PCR-Methode für porzine DNA konnte in allen untersuchten DNA-Extrakten das gewählte Templat amplifiziert werden. Die erhaltenen Ct-Werte waren von der Fixiermethode abhängig. Die ungepufferte Formaldehydlösung führte zu einer stärkeren Degradation der DNA als die gepufferte Fixierlösung und die Kaiserlingmethode.
Im Falle der humanen fixierten Proben konnte das 122 bp lange Templat in al-len untersuchten DNA-Extrakten amplifiziert werden, das 171 bp lange Templat hingegen nicht. Da bei den Museumspräparaten keine Information über die Fixiermethode vorlag, kann jedoch keine Aussage über den Einfluss der Fixiermethode auf die Degradation der DNA getroffen werden.
Abstract (eng)
Envisioning deep understanding and healing of congenital diseases serves as a strong driving force towards intensive research of the human genome, its structure and functions.
Collections of anatomical preparations constitute a large and interesting pool of old DNA for such research work. One such example is the pathological-anatomical museum in Vienna which owns a large collection of formalin fixed preparations. A prerequisite for gene studies is, however, the possibility to ex-tract intact DNA which can be amplified by PCR.
This diploma thesis describes the development and optimization of real-time PCR assays for the detection of human DNA from formalin fixed museum preparations. Furthermore the influence of the fixation method on DNA extraction and PCR amplification was investigated.
Since no information about the fixation methods of the museum preparations was available, porcine heart tissue was fixed by three different methods (with buffered formalin solution, with unbuffered formalin solution and by the historic Kaiserling method) under defined conditions. These samples were used to develop and optimize a real-time PCR assay for the detection of porcine DNA from formalin fixed tissue, to find out if the fixation method affects the extraction and amplification of DNA.
To develop the PCR methods, the gene sequence coding the protein albumin was chosen to design primers and the probe. In the case of the human DNA assay two different primers were designed, one for a 122 bp and one for a 171 bp template. The efficiencies of the optimized PCR methods for porcine and human DNA were found to be 86.1 and 83.3%, respectively.
For DNA extraction, the following methods were compared: an in house devel-oped CTAB protocol, different variants of the CTAB method, two commercial DNA extraction kits and a method recommended in literature, the so called hot alkali extraction.
The CTAB variant with 1% SDS in the extraction buffer and 72 h digest with proteinase K was found to be appropriate. However, this method did not allow extraction of DNA from all museum preparations. The key step was complete digestion of the tissue which could not be achieved in all cases. The most effi-cient extraction method was extraction with a commercial FFPE DNA extraction kit. With this kit, it was possible to extract DNA from each museum sample. The recommended hot alkali extraction method, on the other hand, did not result in satisfactory results with any of the museum samples.
In the case of porcine samples DNA could be amplified in all extracts from for-malin fixed tissues. However, the DNA quality depended on the fixation method. The lowest Ct-value and hence the best DNA quality was achieved with buffered formalin solution and the historic Kaiserling method, whereas unbuffered formalin solution led to poor DNA quality.
In the case of formalin fixed museum preparations, the shorter template but not the longer template was amplified in each tested DNA extract. Unfortunately there is no documentation about the exact fixation solution used and the history of the sample. Hence conclusions concerning the influence of the fixation method on DNA quality cannot be drawn.
Keywords (eng)
PCRDNA extractionformalin fixed Tissue
Keywords (deu)
PCRDNA-ExtraktionFormalin fixierte Gewebe
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1265469
Number of pages
137
Association (deu)
License
Citable links
Other links
Managed by
Details
Metadata
Export formats
Universitätsring 1, 1010 Wien | T
T +43-1-4277-0