Pharmazeutische Transportstudien werden immer wichtiger um vielversprechende Arzneien zu
überprüfen und bekannte Medikamente zu testen. Diese Studien verwenden adhärente Zellkulturen,
die auf Membranen aufgewachsen wurden, um den Transport von pharmazeutischen
Substanzen zwischen apikalem und basolateralem Kompartment zu messen. Eine der adhärenten
Zellkulturen, die für diese Studien verwendet wird, ist die Caco-2 Ziellinie aus dem
menschlichen Grimmdarm. Die ist wegen ihrer Fähigkeit zur funktionellen Differentiation
ein anerkanntes Modell für den menschlichen Dünndarm [Press 08], [Weissenboeck 04]. Mit
Hilfe von Caco-2 Zellkulturen kann die Aufnahme und Absorption von pharmazeutischen
Substanzen im Dünndarm effizient überprüft werden. Caco-2 Zellkulturen teilen sich so lange
bis sie eine dichte Monolage von ausdifferenzierten Epithelzellen bilden. Pharmazeutische
Transportstudien benötigen eine konfluente und sehr dichte Epithelschicht.
Um sowohl die Konfluenz als auch die Zelldichte zu überprüfen wird üblicherweise der Parameter
’TEER’ (transepithelial electrical resistance) verwendet. Der TEERWert gibt Auskunft
über die transepitheliale spezifische Impedanz einer Zellschicht. TEER wird in Ohm cm2 während
einer einzigen Impedanzmessung bei einer Messfrequenz von 12.5 Hz bestimmt. Da die Zellkultur
für die Messung aus ihrer gewohnten Umgebung entfernt werden müssen ist diese
Messung als invasiv zu betrachten.
Um ein ungestörtes Wachstum zu ermöglichen wurde ein an die Wachstumsbedingungen
angepasster Messaufbau entwickelt, mit dem das Konzept des transepithelialen Widerstandes
bis zu Frequenzen von 100 kHz erweitert wurde, um die elektrischen Eigenschaften von Caco-2
Zellschichten genauer zu untersuchen. Die Caco-2 Epithelzellen erzeugen selbst kein elektrisches
Signal. Im Gegensatz zu neuronalen Zelllinien können sie als elektrisch passive Zellen
betrachtet werden. Trotzdem beeinflussen deren biologische Strukturen und Verhalten die
Umgebung der Zellen im Hinblick auf elektrische Parameter. Diese Einflüsse können mit Hilfe von Imedanzmessungen erfasst werden [Coster 96]. Die Zellschicht selbst kann als eine
passive elektrische Schaltung mit variablen Widerständen und Kapazitäten betrachtet werden.
Um diese komplexen Schaltungen zu untersuchen wurde die Methode der Impedanzspektroskopie verwendet. Diese Methode ermöglicht es, Informationen
über resistive, kapazitive, induktive und diffusive Charakteristika des untersuchten Systems zu bestimmen. Angewandt auf Caco-2 Zellkulturen erlaubt es diese Methode die elektrischen
Eigenschaften dieser biologischen Zellen zu untersuchen. Basolaterale Aufzeichnung der Impedanzspektroskopie von Caco-2 Zellen wurde schon mit Hilfe von flachen Kammelektroden
durchgeführt [Fischeneder 09].
Die hier präsentierte Arbeit hat eine transzelluläre Elektrodenkonfiguration mit einer Elektrode
im apikalen Kompartment und einer Elektrode im basolateralen Kompartment zum
Ziel. Die transzelluläre Elektrodenkonfiguration ist speziell dafür geeignet, die Konfluenz einer Zellschicht zu messen und deren ’tight junctions’ zu untersuchen. Das Ziel dieser Arbeit
war es daher, die transepitheliale Impedanz von Caco-2 Monolagen unter Verwendung von mikrostrukturierten Elektroden zu überwachen. Ein angepasster Messaufbau um die
Impedanz in Zweipunktkonfiguration zu messen wurde geplant und entwickelt. Zwei Sorten
von Elektroden, apikale und basolaterale Elektroden, wurden hergestellt und analysiert. Ein
Multiplexer wurde implemeniert um jede gewünschte Verbindungen zwischen den einzelnen
verfügbaren Messelektroden herzustellen. Ein LCR-Meter wurde dazu verwendet ein Messsignal
mit Frequenzen zwischen 50 Hz und 100 kHz zu senden und die resultierende Impedanz
zu messen. Die speziellen Anforderungen einer nicht invasiven Beobachtung des transepithelialen
Widerstandes der Caco-2 Zellen wurden evaluiert und im experimentellen Messaufbau
umgesetzt. Der endgültige Messaufbau wurde sowohl in Hinblick auf Funktionalität
als auch in Hinblick auf Reproduzierbarkeit der Messergebnisse getestet. Die Ergebnisse dieser
Test zeigen die Eignung des Messaufbaus zur Messung der transepithelialen Impedanz. Die
Biokompatibilität konnte für alle Materialien, die in Kontakt mit den Caco-2 Zellen stehen,
bestätigt werden. Es konnten Impedanzspektra von acht Zellkulturen gleichzeitig während der
gesamten Wachstumsperiode aller Kulturen gemessen werden. Es konnte gezeigt werden, dass
die transepitheliale Impedanz einer Caco-2 Monolage während eines Zellzyklus um das zweibis
achtfache anstieg. Signifikante Vorkommnisse während des Zellzyklus wie der Austausch
des Nährmediums konnten charakteristischen Peaks im gemessenen Impedanz Spektrum zugeordnet
werden.
Die Ergebnisse dieser Arbeit helfen nicht nur dabei, den genauen Zeitpunkt der Konfluenz
einer Zellschicht für pharmazeutische Studien zu bestimmen, sondern haben auch zu einem
besseren Verständnis der elektrischen Eigenschaften der humanen Epithelzelllinie ’Caco-2’
geführt.

For the screening of new prospective drugs and testing the effectivity of known medicaments,
pharmaceutical transport studies are increasingly important. These studies use epithelial cells
grown on membranes to measure the transport of pharmaceutical agents from one compartment
to another. One of the adherent cell lines used for these studies is the human colon cell
line Caco-2. The Caco-2 cell line, due to its functional differentiation properties, is recognized
as a model for the human small intestine as reported in [Press 08] and [Weissenboeck 04]. Uptake
and absorption of pharmaceutical agents can be efficiently scanned by transport studies.
The Caco-2 cell culture differentiates to form a dense monolayer. Pharmaceutical transport
studies rely on the confluence and a high density of the epithelial monolayer.
To test for the confluence as well as the cell density, the transepithelial electrical resistance
(TEER) is a widely used parameter. The TEER value gives the transepithelial specific
impedance of a cell layer, measured in Ohm cm2 at the frequency of 12.5 Hz retrieved during
a singular measurement. The conventionally used measurement is invasive to the cell culture
as the cell culture has to be removed from its growth environment.
To avoid disturbance of the cells during measurement, an adapted measurement setup was
designed and fabricated to monitor the cells impedance noninvasively. The concept of transepithelial
resistance was extended to the range up to 100 kHz and to investigate the electrical
properties of the Caco-2 cell layer in detail because Caco-2 cells are epithelial cells that do
not generate electrical signals themselves. In contrast to neuronal cell lines, they have to
be considered electrically passive cells. Nonetheless, their biological structure and behavior
electrically influences the cell’s environment. These influences can be detected by impedance
measurements [Coster 96]. The cell layer itself can be considered a passive electrical circuit
with variable capacitors and resistors.
Complex electrical circuits like the mentioned cell layers can be investigated through
impedance spectroscopy. This method is capable of collecting information on the resistive,
capacitive, inductive and diffusive characteristics of a tested system. When applied to adherent
Caco-2 cell cultures, this method allows investigation of the electrical properties of these
biological cells. Basolateral monitoring of the impedance of Caco-2 cells has been performed
using interdigitated planar electrodes [Fischeneder 09],
The presented work addressed a transwell configuration with one electrode in the apical compartment
and one electrode in the basolateral compartment. The transwell configuration is
an excellent method to measure the confluence of the cell layer and to evaluate the tight junctions.
The aim of this work was to monitor the transepithelial electrical impedance of Caco-2
monolayers using microstructured electrode arrays. An adapted electrical setup for a two
terminal configuration impedance measurement was designed and fabricated. Two types of
electrodes, apical and basolateral electrodes were fabricated and analyzed. A multiplexer was
implemented to establish any desired pairing of available measurement electrodes. An LCR-
7
meter imprinted a signal and measured the impedance in the range of 50 Hz to 100 kHz. Specific
requirements of a non-invasive continuous monitoring of the Caco-2 cells’ transepithelial
impedance spectroscopy were evaluated and implemented into the setup. The final setup was
then tested for functionality as well as for accuracy. Results proved this suitable to measure
the transepithelial impedance. Biocompatibility was confirmed for all materials in contact
with the Caco-2 cells. Monitoring of the transepithelial impedance spectroscopy for eight
wells simultaneously was performed during the complete growth period of a cell culture. The
transepithelial impedance of a Caco-2 monolayer was found to be increased during growth
period by factors ranging from two two eight. Significant events of the cells growth cycle such
as exchange of nutrient medium could be correlated temporally to characteristic peaks of the
measured transepithelial impedance.
The results of this work do not only help in detecting the exact time of a cell layer’s confluence
for pharmaceutical transport studies but have also lead to a better understanding of the
electrical properties of the human epithelial cell line ’Caco-2’.