Title (eng)
Identification and characterization of HDA6 interaction partners and complexes
Parallel title (deu)
Identifizierung und Charakterisierung von HDA6 Interaktionspartnern und Komplexen
Author
Branislava Rakic
Advisor
Werner Aufsatz
Assessor
Hervé Vaucheret
Kazufumi Mochizuki
Abstract (deu)
Die Acetylierung von N-terminalen Histonenden ist eine reversible post-translationale Modifikation und stellt daher einen flexiblen Mechanismus für die Regulation der Transkription dar. Das kontrollierte Zusammenspiel von Histon Acetyltransferasen (HATs) und Histon Deacetylasen (HDAcs) legt Acetylierungslevels von Histonen fest und ist daher eng mit transkriptioneller Aktivierung oder Repression verknüpft. Die Arabidopsis Histon Deacetylase HDA6 ist in "RNA-directed DNA methylation" (RdDM) involviert, einem Regulationsweg, der für das Stilllegen von Transgenen, Transposons und ribosomalen Genen eine Rolle spielt. Neben der Funktion in RdDM wurde für HDA6 auch Rollen in der Regulation der Blühzeit, in der Senezenz und in der Antwort auf Jasmonat, ABA und Salzstress festgestellt. Bis jetzt wurden jedoch weder Interaktionspartner noch Proteinkomplexe von HDA6 identifiziert.
In dieser Arbeit untersuchten wir die Rolle von HDA6 in RdDM und die Mechanismen der seiner Rekrutierung zu RdDM Zielgenen. Wir haben drei neue Mutantenallele von HDA6 charakterisiert, welche für enzymatisch inaktive Proteine kodieren. Interessanterweise zeigen alle drei Mutanten die Reaktivierung von einigen bekannten RdDM Zielgenen, ohne zu einer Abnahme der DNA Methylierung zu führen. Dieses Ergebnis war überraschend, da zuvor eine Rolle von HDA6 in der Aufrechterhaltung von DNA Methylierung festgestellt wurde, welche ein wesentliches Kennzeichen von RdDM darstellt. Dieses Ergebnis deutet auch darauf hin, daß DNA Methylierung nicht ausreichend für RdDM-vermittelte Genrepression ist.
Wir identifizierten mittels eines Interaktionsscreens in Hefe FIBRILLARIN und ein Protein mit einer RNA-Interaktionsdomäne (RRM) als mögliche HDA6 Interaktionspartner. Wir bestätigten diese Interaktionen in planta mittels "bimolecular fluorescence complementation" (BiFC). Beide Proteine besitzen RNA-Bindungsdomänen, was auf eine Rekrutierung von HDA6 direkt mittels siRNAs in einem Methylierungs-unabhängigen Mechanismus hindeuten könnte. Massenspektrometrie von immun-gereinigtem, Epitop-markiertem HDA6 führte zu der Identifizierung von Arabidopsis Orthologen einiger Hefe- und Säugerkomponenten des SIN3 Komplex, was den ersten gereinigten HDA6 Komplex aus Arabidopsis darstellt. Unsere Studien zeigten weiters, dass der Arabidopsis SIN3 Komplex wahrscheinlich nicht in RdDM involviert ist und lassen den Schluß auf wahrscheinliche unterschiedlichen Rollen von HDA6 in RdDM und RdDM-unabhängigen Repressionmechanismen zu.
Abstract (eng)
The acetylation of histone tails is a reversible post-translational modification, and thus provides a flexible mechanism for transcriptional regulation. The controlled action of histone acetyltransferases (HATs) and histone deacetylases (HDACs) spezifiziert specifies the acetylation levels of histones and is therefore linked to transcriptional activation and repression, respectively. The Arabidopsis histone deacetylase HDA6 is involved in RNA-directed DNA methylation (RdDM), a pathway required for silencing of transgenes, transposons and ribosomal RNA (rRNA) genes. Beside its function in RdDM, HDA6 has been implicated in flowering, senescence and jasmonate, ABA and salt stress responses. However, neither interaction partners nor complexes containing HDA6 have been identified so far.
In this work, we investigated the role of HDA6 in the RdDM pathway and the mechanisms of its recruitment to RdDM targets. We have characterized three new mutant alleles of HDA6 that code for enzymatically inactive proteins. Interestingly, they all show transcriptional reactivation of several known RdDM targets without a decrease of DNA methylation. This result was surprising, since HDA6 has been implicated in the maintenance of DNA methylation, a major hallmark of RdDM silencing. It also indicates that methylation is not sufficient for silencing in RdDM.
In a large yeast two hybrid screen, we identified FIBRILLARIN and an RRM domain protein as possible HDA6 interaction partners. Additionally, we confirmed these interactions in planta using bimolecular fluorescence complementation (BiFC). Both proteins have RNA-binding domains, suggesting that HDA6 can be recruited directly via siRNAs in RdDM, which is consistent with a methylation-independent recruitment model. Mass-spectrometry on immunoprecipitated epitope-tagged HDA6 identified several plant orthologs of mammalian and yeast components of the SIN3 complex and represents the first purified HDA6 complex from Arabidopsis. Additionally, our study indicates that the Arabidopsis SIN3-like complex is not involved in RdDM and highlights possibly separate roles of HDA6 in RdDM and non-RdDM silencing.
Keywords (eng)
HDA6RdDMSIN3RNA silencing
Keywords (deu)
HDA6RdDMSIN3RNA silencing
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1271791
rdau:P60550 (deu)
93 S. : Ill., graph. Darst.
Number of pages
93
Association (deu)
Title (eng)
Identification and characterization of HDA6 interaction partners and complexes
Parallel title (deu)
Identifizierung und Charakterisierung von HDA6 Interaktionspartnern und Komplexen
Author
Branislava Rakic
Abstract (deu)
Die Acetylierung von N-terminalen Histonenden ist eine reversible post-translationale Modifikation und stellt daher einen flexiblen Mechanismus für die Regulation der Transkription dar. Das kontrollierte Zusammenspiel von Histon Acetyltransferasen (HATs) und Histon Deacetylasen (HDAcs) legt Acetylierungslevels von Histonen fest und ist daher eng mit transkriptioneller Aktivierung oder Repression verknüpft. Die Arabidopsis Histon Deacetylase HDA6 ist in "RNA-directed DNA methylation" (RdDM) involviert, einem Regulationsweg, der für das Stilllegen von Transgenen, Transposons und ribosomalen Genen eine Rolle spielt. Neben der Funktion in RdDM wurde für HDA6 auch Rollen in der Regulation der Blühzeit, in der Senezenz und in der Antwort auf Jasmonat, ABA und Salzstress festgestellt. Bis jetzt wurden jedoch weder Interaktionspartner noch Proteinkomplexe von HDA6 identifiziert.
In dieser Arbeit untersuchten wir die Rolle von HDA6 in RdDM und die Mechanismen der seiner Rekrutierung zu RdDM Zielgenen. Wir haben drei neue Mutantenallele von HDA6 charakterisiert, welche für enzymatisch inaktive Proteine kodieren. Interessanterweise zeigen alle drei Mutanten die Reaktivierung von einigen bekannten RdDM Zielgenen, ohne zu einer Abnahme der DNA Methylierung zu führen. Dieses Ergebnis war überraschend, da zuvor eine Rolle von HDA6 in der Aufrechterhaltung von DNA Methylierung festgestellt wurde, welche ein wesentliches Kennzeichen von RdDM darstellt. Dieses Ergebnis deutet auch darauf hin, daß DNA Methylierung nicht ausreichend für RdDM-vermittelte Genrepression ist.
Wir identifizierten mittels eines Interaktionsscreens in Hefe FIBRILLARIN und ein Protein mit einer RNA-Interaktionsdomäne (RRM) als mögliche HDA6 Interaktionspartner. Wir bestätigten diese Interaktionen in planta mittels "bimolecular fluorescence complementation" (BiFC). Beide Proteine besitzen RNA-Bindungsdomänen, was auf eine Rekrutierung von HDA6 direkt mittels siRNAs in einem Methylierungs-unabhängigen Mechanismus hindeuten könnte. Massenspektrometrie von immun-gereinigtem, Epitop-markiertem HDA6 führte zu der Identifizierung von Arabidopsis Orthologen einiger Hefe- und Säugerkomponenten des SIN3 Komplex, was den ersten gereinigten HDA6 Komplex aus Arabidopsis darstellt. Unsere Studien zeigten weiters, dass der Arabidopsis SIN3 Komplex wahrscheinlich nicht in RdDM involviert ist und lassen den Schluß auf wahrscheinliche unterschiedlichen Rollen von HDA6 in RdDM und RdDM-unabhängigen Repressionmechanismen zu.
Abstract (eng)
The acetylation of histone tails is a reversible post-translational modification, and thus provides a flexible mechanism for transcriptional regulation. The controlled action of histone acetyltransferases (HATs) and histone deacetylases (HDACs) spezifiziert specifies the acetylation levels of histones and is therefore linked to transcriptional activation and repression, respectively. The Arabidopsis histone deacetylase HDA6 is involved in RNA-directed DNA methylation (RdDM), a pathway required for silencing of transgenes, transposons and ribosomal RNA (rRNA) genes. Beside its function in RdDM, HDA6 has been implicated in flowering, senescence and jasmonate, ABA and salt stress responses. However, neither interaction partners nor complexes containing HDA6 have been identified so far.
In this work, we investigated the role of HDA6 in the RdDM pathway and the mechanisms of its recruitment to RdDM targets. We have characterized three new mutant alleles of HDA6 that code for enzymatically inactive proteins. Interestingly, they all show transcriptional reactivation of several known RdDM targets without a decrease of DNA methylation. This result was surprising, since HDA6 has been implicated in the maintenance of DNA methylation, a major hallmark of RdDM silencing. It also indicates that methylation is not sufficient for silencing in RdDM.
In a large yeast two hybrid screen, we identified FIBRILLARIN and an RRM domain protein as possible HDA6 interaction partners. Additionally, we confirmed these interactions in planta using bimolecular fluorescence complementation (BiFC). Both proteins have RNA-binding domains, suggesting that HDA6 can be recruited directly via siRNAs in RdDM, which is consistent with a methylation-independent recruitment model. Mass-spectrometry on immunoprecipitated epitope-tagged HDA6 identified several plant orthologs of mammalian and yeast components of the SIN3 complex and represents the first purified HDA6 complex from Arabidopsis. Additionally, our study indicates that the Arabidopsis SIN3-like complex is not involved in RdDM and highlights possibly separate roles of HDA6 in RdDM and non-RdDM silencing.
Keywords (eng)
HDA6RdDMSIN3RNA silencing
Keywords (deu)
HDA6RdDMSIN3RNA silencing
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1271792
Number of pages
93
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