Das Thema dieser Arbeit war die Bearbeitung von grundlegenden Fragestellungen im Zusammenhang mit dem molekular-biologischen Nachweis von lebensmittelpathogenen Bakterien. Die Methode der welche dafür eingesetzt werden sollte war die Real-time Polymerase-Kettenreaktion (qPCR). Dieser Ansatz des molekularbiologischen Nachweises lebensmittelpathogener Bakterien sollte beispielhaft mit Listeria monocytogenes durchgeführt werden. In einem ersten Schritt sollte ein existierender L. monocytogenes spezifischer konventioneller PCR-Assay erweitert werden werden um den Assay in einer qPCR Anwendung verwenden zu können. Basierend auf diesem qPCR-Assay wurde im folgenden eine kombinierte Anreicherungs/qPCR Methode entwickelt. Parallel dazu wurde die Möglichkeit der direkten quantitativen Analyse aus dem Lebensmittel ohne vorbereitende Schritte untersucht. Der Einfluss der Lebensmittelmatrix und der verwendeten Anreicherungsmedien auf die Efffizienz der qPCR Reaktion wurde untersucht. Ein weiterer Schritt in Richtung zuverlässiger molekularbiologischer Nachweisverfahren für die Detektion lebensmittelpathogener Bakterien ist letztendlichen die Berücksichtigung der Notwendigkeit einer analytischen Kette bestehend aus Probenvorbereitung, DNA Isolation/Aufreinigung und qPCR Detektion. Daher wurde eine neue Probenvorbereitungsmethode entwickelt um die Nachteile bestehender Methodik zu vermeiden. Ein kritischer Punkt während der Entwicklung der neuen Probenvorbereitungsmethode war das Auffinden der präsumptiven Zielkeime. Da lebensmittelpathogene Bakterien farblos und daher in der Probe unsichtbar sind war es notwendig sie während der Entwicklung durch färbige Indikatoren zu ersetzen. Es wurde daher der chromogene Gram positive Bakterienstamm Micrococcus roseus eingesetzt um die Untersuchung einer so großen Anzahl an zu testenden physikalischen und chemischen Parametern in akzeptabler Zeit und mit den vorhandenen Resourcen durchzuführen.

This work establishes a basis for reliable use of molecular biological methods for food pathogen detection with respect to Listeria monocytogenes. Real-time PCR (qPCR) was the detection method of choice. As a first step an existing conventional qPCR assay for L. monocytogenes was extended to qPCR use by constructing and testing an appropriate probe design. Subsequently, a rapid method, including the newly developed qPCR assay, was developed. In this way the qPCR assay was combined with a short enrichment protocol derived from the standard method (ISO 11290). Concurrently the possibility of direct quantification of the target bacteria can be investigated to obtain quantitative information. The influence of food matrices and enrichment media on qPCR performance with respect to inhibitory effects was investigated. In a next step towards reliable molecular biology based food pathogen detection, the necessity of an analytical chain, consisting of sample preparation, DNA isolation/purification and qPCR detection was considered. Hence, a sample preparation method is proposed to circumvent the disadvantages of combined and direct detection and to create the optimal conditions for qPCR detection protocols. During development of this new sample preparation method the crucial point in every step was the localization of the target organisms. Most target pathogens in food and clinical diagnostics are colourless and invisible. Consequently, it is necessary to simulate the bacterial targets from the beginning of the development of a new protocol to establish the necessary chemical and physical parameters. Chromogenic bacteria meet that prerequisite. Therefore Micrococcus roseus was used in the developmental stage of the new method protocol