Otitis media, die Mittelohrentzündung, ist eine weitverbreitete Krankheit bei Kindern unter drei Jahren und wird hauptsächlich durch drei bakterielle Erreger verursacht - Streptococcus pneumoniae, nontypeable Haemophilus influenzae (NTHI) und Moraxella catarrhalis. Ein Ansteigen der Antibiotikaresistenz sowie die mit der Krankheit assoziierte finanzielle und ökonomische Last für die Gesundheitssysteme von Staaten begründen den Bedarf eines Impfstoffes gegen die Mittelohrentzündung. Meine Studien beschäftigten sich mit der Identifikation, Selektion und Charakterisierung potentieller neuer Impfstoffantigene von NTHI und M. catarrhalis, den zweit- und dritthäufigsten Erregern der Mittelohrentzündung. Die Antigenliste, welche durch die Anwendung der Antigenomtechnologie (AIP®) in vorangegangenen Studien generiert wurde, stellte die Basis für diese Studien dar. Von 214 M. catarrhalis und 156 NTHI Antigenen wurden etwa 20 Proteine zur weiteren Evaluierung basierend auf Gendistribution, Antigenom-Screen hits und Peptide ELISA selektiert. Parallel und ergänzend zur Antigenomtechnologie wurden Proteomanalysen durchgeführt, indem Proteine in Membranpreparationen (gesamte Membran, äußere Membran, Membranvesikel) mittels Massenspektrometrie identifiziert wurden. Dies erlaubte eine Anreicherung an Membranproteinen sowie die Bestimmung der Membranproteome der beiden Bakterien. Weiters wurden Membranvesikel von M. catarrhalis Kulturen, die unter eisenlimitierenden Bedingungen gewachsen sind, isoliert. Vergleichende SDS-PAGE zeigte, dass speziell Proteine zwischen 70 und 130 kDa unter eisenlimitierenden Bedingungen überexprimiert wurden. Aufgrund dieser Daten und der häufigen Selektion von Eisentransportern mittels AIP® stellte der Eisenmetabolismus einen Schwerpunkt dieser Studien dar. Da die Konzentration an freiem Eisen im menschlichen Körper sehr gering ist, scheinen diese Proteine eine wichtige Rolle in der Pathogenese und Virulenz zu spielen. Im Zuge dieser Studien wurde mittels Western blot und Durchflusszytometrie (NTHI) sowie Microarrayanalysen (M. catarrhalis) gezeigt, dass die Expression jener Antigene, die am Eisentransport beteiligt sind, durch Eisen reguliert wird. Außerdem wurden acht selektierte Gendeletionsmutanten in M. catarrhalis generiert, um die Wesentlichkeit der jeweiligen Gene für das Überleben und das bakterielle Wachstum zu bestimmen. Die msp22 (MCR_1416) Gendeletionsmutante weiste erhöhte Sensitivität gegenüber eisenlimitierenden Bedingungen auf und wurde daher zur weiteren Charakterisierung herangezogen. Msp22 ist ein Cytochrom c Homolog und Immunisierung mit rekombinantem Protein führte zu Protektion in einem Mausinfektionsmodell. Außerdem führte die Vakzination mit zwei weiteren Proteinen, der „plug“-Domäne eines TonB-abhängigen Rezeptors (MCR_0076) sowie OppA (MCR_1303) zu einer stark verminderten Bakterienzahl in der Mauslunge nach Infektion mit M. catarrhalis. Zusätzlich wurde Msp22 mittels des Shuttlevektors pEMCJH04-KAN heterolog in M. catarrhalis exprimiert und anschließend über Ni-Sepharosesäulchen gereinigt. Es konnte gezeigt werden, dass das gereinigte Protein kovalent an Häm gebunden ist und häm-abhängige Peroxidaseaktivität aufweist. Zusammenfassend unterstützten diese Studien die Charakterisierung und Evaluierung potentieller neuer M. catarrhalis und NTHI Antigene für die Entwicklung eines Impfstoffs gegen Otitis media.

Otitis media, a very common disease of early childhood is caused by three major bacterial pathogens – Streptococcus pneumoniae, nontypeable Haemophilus influenzae (NTHI) and Moraxella catarrhalis. An increasing resistance to antibiotics and the economic burden associated with otitis media raise the demand for a vaccine to prevent this disease. These studies focussed on the identification, selection and characterization of potential novel vaccine antigens from NTHI and M. catarrhalis, the second and third most frequent antigens associated with otitis media. The list of antigens generated by the antigenome approach (AIP®) in previous studies provided the basis for these studies. Out of 214 M. catarrhalis and 156 NTHI antigens, approximately 20 proteins per pathogen were chosen for further research based on gene distribution, antigenome-screen hits and peptide ELISA. In parallel, proteomic analyses were performed in order to verify and complement the results obtained by the antigenome approach. Whole membrane preparations (NTHI and M. catarrhalis), outer membrane preparations (NTHI) as well as outer membrane vesicles (OMVs) (M. catarrhalis) were subjected to mass spectrometric analysis. Thus, an enrichment of membrane proteins was achieved, leading to the identification of the membrane proteomes of M. catarrhalis and NTHI. Furthermore, OMVs isolated from M. catarrhalis cultures grown in iron-depleted medium were isolated and subjected to SDS-PAGE. This revealed that especially proteins between 70 and 130 kDa were upregulated during iron-limiting conditions. Due to these observations, the frequent selection of iron transport proteins by AIP®, and their crucial role in pathogenesis, one main focus of these studies was the examination of iron-regulated proteins. In the present studies, iron transporters were shown to be overexpressed during iron limitation in vitro by Western blot analysis and flow cytometry (NTHI) as well as Microarray analysis (M. catarrhalis). Moreover, eight selected gene deletion mutants were generated in M. catarrhalis to examine the essentiality of the genes for survival and bacterial growth. The msp22 (MCR_1416) gene deletion mutant appeared to be more sensitive to iron limitation compared to the wild type and all other gene deletion mutants. Thus, Msp22 was chosen for further characterization. Msp22 is a cytochrome c homologue, and immunization with the recombinant protein conferred protection in a mouse pulmonary clearance model. Moreover, vaccination with two additional candidate antigens, the “plug” domain of a TonB-dependent receptor (MCR_0076) as well as OppA (MCR_1303), enhanced pulmonary clearance upon bacterial challenge. Finally, Msp22 was heterologously expressed in M. catarrhalis using M. catarrhalis shuttle plasmid pEMCJH04-KAN, and subsequently purified on Ni-sepharose columns. Purified Msp22 was demonstrated to be covalently bound to heme and to exhibit heme-dependent peroxidase activity. In summary, these studies strongly supported the characterization and evaluation of potential novel M. catarrhalis and NTHI antigens for the development of an otitis media vaccine.