Title (eng)
Identification and characterization of novel type III secreted proteins in Chlamydia infection
Parallel title (deu)
Identifikation und Charakterisierung von neuen Typ III sezernierten Proteinen in Chlamydia Infektionen
Author
Lena Gehre
Advisor
Thomas Rattei
Assessor
Thomas Rattei
Abstract (deu)
Chlamydiae sind obligat intrazelluläre Parasiten, welche ein breites Spektrum von Organismen wie Tiere, Insekten oder Amöben infizieren. Diese Gram-negativen Bakterien stellen eine weltweit vermeidbare Hauptursache für Blindheit und Unfruchtbarkeit in Menschen dar. Infizieren Chlamydiae eine eukaryotische Wirtszelle, so bilden sie ein spezielles Kompartiment aus, die Inklusion, in der sie sich vermehren und von der infektiösen, metabolisch inaktiven Form in die nicht-infektiöse, aber metabolisch aktive Form konvertieren. Beide Formen besitzen ein Typ III Sekretionssystem, mit dem sie potentiell toxische Effektorproteine in die Wirtszelle translozieren.
Aufgrund des intrazellulären Lebensstils von Chlamydiae konnten bis heute noch keine Strategien entwickelt werden, sie genetisch zu manipulieren. Dies wirkt sich erschwerend auf die Identifikation neuer Effektorproteine aus. Eine zusätzliche Komplikation wird dadurch hervorgerufen, dass die molekulare Erkennung von Effektoren durch die Typ III Sekretionsmaschinerie noch ungeklärt ist. Dennoch wird die Hypothese, dass sich dieses Erkennungssignal in den ersten 20 Aminosäuren des N-Terminus befinde, von einigen Versuchen gestützt.
Um neue Typ III sezernierte Proteine zu identifizieren, bedienten wir uns des schon veröffentlichten Versuchsansatzes, bei dem der Sekretionstest von Chlamydiae-Effektoren in einem heterologen Typ III Sekretionssystem von Shigella flexneri durchgeführt wurde. Hierfür erstellten wir Chimären, welche aus den ersten 20 Aminosäuren des N-Terminus des potentiellen Effektors und einem Reporter-Protein, der Calmodulin-abhängigen Adenylatcyclase (Cya) von Bordetella pertussis, bestanden. Diese Chimären exprimierten wir in unterschiedlichen Shigella flexneri-Stämmen. Durch den Gebrauch eines Antikörpers gegen Cya konnten wir die Chimären lokalisieren und ihre Sekretionseigenschaften bestimmen.
Um eine Liste von zu testenden Kandidaten zu erstellen machten wir uns das Wissen zunutze, dass viele Effektoren Signaturen von Proteindomänen, die typischerweise in Eukaryoten gefunden werden, besitzen. Durch die Software „Effective“ erhielten wir vorausberechnete Listen von Proteinen aus den Proteomen von Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae und Chlamydophila caviae, welche eine Anreicherung dieser eukaryotisch-ähnlichen Domänen besitzen. Anhand des oben erwähnten heterologen Sekretionstests konnten wir zeigen, dass 17/25 getesteten Kandidaten tatsächlich durch ein Typ III Sekretionssystem sezerniert wurden.
Zusätzlich dazu unterzogen wir eine Auswahl an Proteinen der Umweltchlamydien, welche eine Rolle im Glykogenmetabolismus spielen, ebenfalls dem Sekretionstest. Diese Auswahl wurde hinsichtlich der Funktionen dieser Enzyme getroffen, welche diese bei einer Stabilisierung der Endosymbiosebildung zwischen einem Cyanobiont und einem heterotrophen Organismus erfüllt haben könnten. Wir zeigten, dass fast alle diese Enzyme sezerniert wurden, und dass einige von ihnen am engsten mit Pflanzenhomologen verwandt zu sein scheinen. Dies unterstützt die Hypothese, dass Chlamydiae eine unabdingbare Rolle in der frühen Entstehungsgeschichte der heutigen Pflanze einnahm.
Weiters untersuchten wir Homologe dieser Enzyme in C. trachomatis und C. pneumoniae auf unterschiedliche Sekretionseigenschaften, da es bekannt ist, dass nur C. trachomatis Glykogen akkumuliert. Wir zeigten Unterschiede auf und gaben Anregungen für weitere Überlegungen.
Abstract (eng)
Chlamydiae are obligate intracellular parasites infecting a broad spectrum of organisms such as animals, insects and amoeba. These gram-negative bacteria are worldwide a major cause of preventable blindness and infertility in humans. Upon infection of a eukaryotic host cell Chlamydiae multiply within a parasitophorous compartment termed inclusion, where they also undergo conversion from an infectious, metabolically rather inert form to a non-infectious, metabolically active form. Both forms possess a type III secretion system in order to translocate potentially toxic effector proteins to targets within the host cell.
No genetic tools to manipulate Chlamydiae are available so far due to their obligate intracellular lifestyle, hampering the examination of putative secreted effectors. The identification of type III secreted proteins is additionally complicated by the fact that the molecular recognition of effectors by a type III machinery is still elusive. However, various experiments suggest a signal in the 20 amino terminal amino acids of the effectors.
We made use of the already published approach of testing putative chlamydial effectors in a heterologous type III secretion system of Shigella flexneri in order to identify novel type III secreted proteins. For this purpose we designed chimeras consisting out of the 20 amino terminal amino acids of a candidate protein fused to a reporter, the calmodulin-dependent adenylate cyclase (Cya) of Bordetella pertussis. These chimeras were expressed in different strains of Shigella flexneri. By applying an antibody against Cya we could localize the chimeras and determine their characteristics of secretion.
In order to create a list of candidates that we subsequently subjected to this secretion test we made use of the finding that many effectors have been shown to contain protein domain signatures that are typically found in eukaryotes. The software “Effective” gave us precalculated lists for proteins enriched in these “eukaryotic-like domains” in the proteomes of Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae and Chlamydophila caviae. With the previously mentioned heterologous secretion test we demonstrated that 17/25 chosen candidates were positive for type III secretion. The software “Effective” is thus a very useful approach, but it can only be used additionally, since other proteins we tested as positive were not listed by this software.
Additionally, we tested an assortment of proteins of environmental Chlamydiae engaged in glycogen metabolism for secretion. This assortment was chosen regarding the function these enzymes could have fulfilled to stabilize the formation of endosymbiosis between a cyanobiont and a heterotrophic organism. We showed that almost all of these enzymes are indeed secreted and that some of them seem to be closest related to plant homologs, strengthening the hypothesis of an indispensable role of Chlamydiae in the early history of development of today’s plants.
We further examined if these enzymes have different secretion characteristics in C. trachomatis and C. pneumoniae, knowing that only C. trachomatis accumulates glycogen. We could state differences here and gave suggestions for further thoughts.
Keywords (eng)
Type III SecretionChlamydiae
Keywords (deu)
Typ III SekretionChlamydiae
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1279008
rdau:P60550 (deu)
90 S. : Ill., graph. Darst.
Number of pages
90
Association (deu)
Title (eng)
Identification and characterization of novel type III secreted proteins in Chlamydia infection
Parallel title (deu)
Identifikation und Charakterisierung von neuen Typ III sezernierten Proteinen in Chlamydia Infektionen
Author
Lena Gehre
Abstract (deu)
Chlamydiae sind obligat intrazelluläre Parasiten, welche ein breites Spektrum von Organismen wie Tiere, Insekten oder Amöben infizieren. Diese Gram-negativen Bakterien stellen eine weltweit vermeidbare Hauptursache für Blindheit und Unfruchtbarkeit in Menschen dar. Infizieren Chlamydiae eine eukaryotische Wirtszelle, so bilden sie ein spezielles Kompartiment aus, die Inklusion, in der sie sich vermehren und von der infektiösen, metabolisch inaktiven Form in die nicht-infektiöse, aber metabolisch aktive Form konvertieren. Beide Formen besitzen ein Typ III Sekretionssystem, mit dem sie potentiell toxische Effektorproteine in die Wirtszelle translozieren.
Aufgrund des intrazellulären Lebensstils von Chlamydiae konnten bis heute noch keine Strategien entwickelt werden, sie genetisch zu manipulieren. Dies wirkt sich erschwerend auf die Identifikation neuer Effektorproteine aus. Eine zusätzliche Komplikation wird dadurch hervorgerufen, dass die molekulare Erkennung von Effektoren durch die Typ III Sekretionsmaschinerie noch ungeklärt ist. Dennoch wird die Hypothese, dass sich dieses Erkennungssignal in den ersten 20 Aminosäuren des N-Terminus befinde, von einigen Versuchen gestützt.
Um neue Typ III sezernierte Proteine zu identifizieren, bedienten wir uns des schon veröffentlichten Versuchsansatzes, bei dem der Sekretionstest von Chlamydiae-Effektoren in einem heterologen Typ III Sekretionssystem von Shigella flexneri durchgeführt wurde. Hierfür erstellten wir Chimären, welche aus den ersten 20 Aminosäuren des N-Terminus des potentiellen Effektors und einem Reporter-Protein, der Calmodulin-abhängigen Adenylatcyclase (Cya) von Bordetella pertussis, bestanden. Diese Chimären exprimierten wir in unterschiedlichen Shigella flexneri-Stämmen. Durch den Gebrauch eines Antikörpers gegen Cya konnten wir die Chimären lokalisieren und ihre Sekretionseigenschaften bestimmen.
Um eine Liste von zu testenden Kandidaten zu erstellen machten wir uns das Wissen zunutze, dass viele Effektoren Signaturen von Proteindomänen, die typischerweise in Eukaryoten gefunden werden, besitzen. Durch die Software „Effective“ erhielten wir vorausberechnete Listen von Proteinen aus den Proteomen von Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae und Chlamydophila caviae, welche eine Anreicherung dieser eukaryotisch-ähnlichen Domänen besitzen. Anhand des oben erwähnten heterologen Sekretionstests konnten wir zeigen, dass 17/25 getesteten Kandidaten tatsächlich durch ein Typ III Sekretionssystem sezerniert wurden.
Zusätzlich dazu unterzogen wir eine Auswahl an Proteinen der Umweltchlamydien, welche eine Rolle im Glykogenmetabolismus spielen, ebenfalls dem Sekretionstest. Diese Auswahl wurde hinsichtlich der Funktionen dieser Enzyme getroffen, welche diese bei einer Stabilisierung der Endosymbiosebildung zwischen einem Cyanobiont und einem heterotrophen Organismus erfüllt haben könnten. Wir zeigten, dass fast alle diese Enzyme sezerniert wurden, und dass einige von ihnen am engsten mit Pflanzenhomologen verwandt zu sein scheinen. Dies unterstützt die Hypothese, dass Chlamydiae eine unabdingbare Rolle in der frühen Entstehungsgeschichte der heutigen Pflanze einnahm.
Weiters untersuchten wir Homologe dieser Enzyme in C. trachomatis und C. pneumoniae auf unterschiedliche Sekretionseigenschaften, da es bekannt ist, dass nur C. trachomatis Glykogen akkumuliert. Wir zeigten Unterschiede auf und gaben Anregungen für weitere Überlegungen.
Abstract (eng)
Chlamydiae are obligate intracellular parasites infecting a broad spectrum of organisms such as animals, insects and amoeba. These gram-negative bacteria are worldwide a major cause of preventable blindness and infertility in humans. Upon infection of a eukaryotic host cell Chlamydiae multiply within a parasitophorous compartment termed inclusion, where they also undergo conversion from an infectious, metabolically rather inert form to a non-infectious, metabolically active form. Both forms possess a type III secretion system in order to translocate potentially toxic effector proteins to targets within the host cell.
No genetic tools to manipulate Chlamydiae are available so far due to their obligate intracellular lifestyle, hampering the examination of putative secreted effectors. The identification of type III secreted proteins is additionally complicated by the fact that the molecular recognition of effectors by a type III machinery is still elusive. However, various experiments suggest a signal in the 20 amino terminal amino acids of the effectors.
We made use of the already published approach of testing putative chlamydial effectors in a heterologous type III secretion system of Shigella flexneri in order to identify novel type III secreted proteins. For this purpose we designed chimeras consisting out of the 20 amino terminal amino acids of a candidate protein fused to a reporter, the calmodulin-dependent adenylate cyclase (Cya) of Bordetella pertussis. These chimeras were expressed in different strains of Shigella flexneri. By applying an antibody against Cya we could localize the chimeras and determine their characteristics of secretion.
In order to create a list of candidates that we subsequently subjected to this secretion test we made use of the finding that many effectors have been shown to contain protein domain signatures that are typically found in eukaryotes. The software “Effective” gave us precalculated lists for proteins enriched in these “eukaryotic-like domains” in the proteomes of Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae and Chlamydophila caviae. With the previously mentioned heterologous secretion test we demonstrated that 17/25 chosen candidates were positive for type III secretion. The software “Effective” is thus a very useful approach, but it can only be used additionally, since other proteins we tested as positive were not listed by this software.
Additionally, we tested an assortment of proteins of environmental Chlamydiae engaged in glycogen metabolism for secretion. This assortment was chosen regarding the function these enzymes could have fulfilled to stabilize the formation of endosymbiosis between a cyanobiont and a heterotrophic organism. We showed that almost all of these enzymes are indeed secreted and that some of them seem to be closest related to plant homologs, strengthening the hypothesis of an indispensable role of Chlamydiae in the early history of development of today’s plants.
We further examined if these enzymes have different secretion characteristics in C. trachomatis and C. pneumoniae, knowing that only C. trachomatis accumulates glycogen. We could state differences here and gave suggestions for further thoughts.
Keywords (eng)
Type III SecretionChlamydiae
Keywords (deu)
Typ III SekretionChlamydiae
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1279009
Number of pages
90
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