Title (eng)
Recombinant GABAA receptor expression in the baculovirus expression system
Parallel title (deu)
Rekombinante GABAA Rezeptor Expression im Baculovirus Expressionssystem
Author
Katharina Grote
Advisor
Werner Sieghart
Assessor
Johannes Berger
Wolfram Welte
Abstract (deu)
Die γ Aminobuttersäure (GABA) ist die am häufigsten vorkommende inhibitorische Neurotransmitter Substanz im zentralen Nervensystem von Säugetieren. GABA wirkt über zwei verschiedene Klassen von Rezeptoren, die GABAA-Rezeptoren, die Cl—Kanäle sind, welche durch GABA geöffnet werden können, und die GABAB-Rezeptoren, die indirekt über second messenger systems an Ca2+ oder K+ Kanäle gekoppelt sind. GABAA-Rezeptoren bestehen aus fünf Untereinheiten, die acht verschiedenen Untereinheitsklassen angehören können. Die Mehrheit der Rezeptoren besteht aus zwei α, zwei β und einer γ Untereinheiten.
Neben GABA können viele Wirkstoffe, wie Benzodiazepine, Barbiturate, Steroide, Anästhetika oder Konvulsiva, an GABAA Rezeptoren binden und diese modulieren. Wie bei den meisten Rezeptoren der cys loop receptor super family, ist die genaue Struktur des GABAA Rezeptors bis jetzt nicht bekannt. Ziel dieser Arbeit war die Produktion und Reinigung von großen Mengen rekombinanter hetero oligomerer (alpha1-beta3-gamma2) GABAA-Rezeptoren, die anschließend mittels Kristallisations-versuchen, photo affinity labeling oder surface plasmon resonance zur strukturellen Analyse verwendet werden sollten.
Zu diesem Zweck wurden drei verschiedene Untereinheits Kombinationen (α1β3His8γ2, α1β3γ2His8 und α1β3γ2His12) im Baculovirus Expressionssystem in Sf9 Zellen exprimiert, um diese dann im großen Maßstab zu reinigen. Das α1β3γ2His12 Konstrukt wurde neu in einen pBAC4x 1 Vektor kloniert. Nachdem stabile Virenstocks für alle Kombinationen erzeugt wurden, wurden die besten Expressionsbedingungen für jeden Rezeptortyp mittels [3H]Muscimol und [3H]Benzodiazepin Bindungsstudien bestimmt. Der Abbau der Proteine wurde mittels SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, Coomassie blue staining und Western blot analysis untersucht. Die Reinigung der Rezeptoren über deren His Tag mittels einer Ni NTA Säule (und einer Benzodiazepin beinhaltenden Affinitätssäule für den α1β3His8γ2 Rezeptor) ergab unterschiedliche Ergebnisse. Mittels 2-Stufenreinigung konnte der α1β3His8γ2 Rezeptor mit einer geschätzten Reinheit von 90% und geringem Abbau der Untereinheiten, allerdings mit sehr geringer Ausbeute, gereinigt werden. Die α1β3γ2His8 und α1β3γ2His12 Rezeptoren zeigten eine verminderte Expression und Abbauprodukte und somit eine geringere Ausbeute der Konstrukte als beim α1β3His8γ2 Rezeptor. Da für eine Reinigung ein Minimum an intakten Rezeptoren in der Membran vorhanden sein muss, wird in Zukunft das α1β3His8γ2 Konstrukt mit einer 2 Stufenreinigung für weitere Strukturanalysen verwendet werden.
Abstract (eng)
The γ aminobutyric acid (GABA) is the most abundant inhibitory neurotransmitter in the mammalian central nervous system. GABA acts via two different classes of receptors, the GABAA receptors, which are Cl- channels that can be opened by GABA and the GABAB receptors, which are indirectly coupled to Ca2+ and K+ channels via second messenger systems. GABAA receptors are composed of five subunits that can belong to eight different subunit classes. The majority of receptors are composed of two α, two β and one γ subunits.
In addition to GABA, many drugs, such as benzodiazepines, barbiturates, steroids, anaesthetics, and convulsants, are able to bind to and thereby modulate the GABAA receptors. The exact molecular structure is still unknown, as it is the case for most receptors of the cys loop receptor super family. Aim of this thesis was to produce and purify large amounts of recombinant hetero oligomeric (alpha1 beta3 gamma2) GABAA receptors for subsequent structural analysis, such as crystallization, photo affinity labeling or surface plasmon resonance investigations.
For that, receptors with three different subunit compositions (α1β3His8γ2, α1β3γ2His8 and α1β3γ2His12) were expressed using the baculovirus expression system in Sf9 cells for large scale purification. The α1β3γ2His12 construct was cloned newly into a pBac4x 1 vector. After generating stable baculovirus stocks for all constructs, the best expression conditions were determined for each receptor type using [3H]muscimol and [3H]benzodiazepine binding studies. Degradation of the proteins was investigated by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, Coomassie blue staining and Western blot analysis. Purification of the receptors via their His tag using a Ni NTA column (and a benzodiazepine containing affinity column for the α1β3His8γ2 construct) provided dissimilar results. In a two step purification the α1β3His8γ2 receptor resulted in an estimated purity of 90% with little degradation of the subunits, but with a low yield. The α1β3γ2His8 and the α1β3γ2His12 receptors presented a reduced overall expression with degradation products of the subunits and thus the recovery was lower as for the α1β3His8γ2 receptor. Since a minimum of functional receptors in the membrane is needed for purification, the expressed α1β3His8γ2 construct with a two step purification will be used for further structural analysis.
Keywords (eng)
GABA receptorbaculovirus expression systemprotein purification
Keywords (deu)
GABAA RezeptorBaculovirus ExpressionssystemProteinreinigung
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1281670
rdau:P60550 (deu)
110 S. : Ill., graph. Darst.
Number of pages
112
Association (deu)
Title (eng)
Recombinant GABAA receptor expression in the baculovirus expression system
Parallel title (deu)
Rekombinante GABAA Rezeptor Expression im Baculovirus Expressionssystem
Author
Katharina Grote
Abstract (deu)
Die γ Aminobuttersäure (GABA) ist die am häufigsten vorkommende inhibitorische Neurotransmitter Substanz im zentralen Nervensystem von Säugetieren. GABA wirkt über zwei verschiedene Klassen von Rezeptoren, die GABAA-Rezeptoren, die Cl—Kanäle sind, welche durch GABA geöffnet werden können, und die GABAB-Rezeptoren, die indirekt über second messenger systems an Ca2+ oder K+ Kanäle gekoppelt sind. GABAA-Rezeptoren bestehen aus fünf Untereinheiten, die acht verschiedenen Untereinheitsklassen angehören können. Die Mehrheit der Rezeptoren besteht aus zwei α, zwei β und einer γ Untereinheiten.
Neben GABA können viele Wirkstoffe, wie Benzodiazepine, Barbiturate, Steroide, Anästhetika oder Konvulsiva, an GABAA Rezeptoren binden und diese modulieren. Wie bei den meisten Rezeptoren der cys loop receptor super family, ist die genaue Struktur des GABAA Rezeptors bis jetzt nicht bekannt. Ziel dieser Arbeit war die Produktion und Reinigung von großen Mengen rekombinanter hetero oligomerer (alpha1-beta3-gamma2) GABAA-Rezeptoren, die anschließend mittels Kristallisations-versuchen, photo affinity labeling oder surface plasmon resonance zur strukturellen Analyse verwendet werden sollten.
Zu diesem Zweck wurden drei verschiedene Untereinheits Kombinationen (α1β3His8γ2, α1β3γ2His8 und α1β3γ2His12) im Baculovirus Expressionssystem in Sf9 Zellen exprimiert, um diese dann im großen Maßstab zu reinigen. Das α1β3γ2His12 Konstrukt wurde neu in einen pBAC4x 1 Vektor kloniert. Nachdem stabile Virenstocks für alle Kombinationen erzeugt wurden, wurden die besten Expressionsbedingungen für jeden Rezeptortyp mittels [3H]Muscimol und [3H]Benzodiazepin Bindungsstudien bestimmt. Der Abbau der Proteine wurde mittels SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, Coomassie blue staining und Western blot analysis untersucht. Die Reinigung der Rezeptoren über deren His Tag mittels einer Ni NTA Säule (und einer Benzodiazepin beinhaltenden Affinitätssäule für den α1β3His8γ2 Rezeptor) ergab unterschiedliche Ergebnisse. Mittels 2-Stufenreinigung konnte der α1β3His8γ2 Rezeptor mit einer geschätzten Reinheit von 90% und geringem Abbau der Untereinheiten, allerdings mit sehr geringer Ausbeute, gereinigt werden. Die α1β3γ2His8 und α1β3γ2His12 Rezeptoren zeigten eine verminderte Expression und Abbauprodukte und somit eine geringere Ausbeute der Konstrukte als beim α1β3His8γ2 Rezeptor. Da für eine Reinigung ein Minimum an intakten Rezeptoren in der Membran vorhanden sein muss, wird in Zukunft das α1β3His8γ2 Konstrukt mit einer 2 Stufenreinigung für weitere Strukturanalysen verwendet werden.
Abstract (eng)
The γ aminobutyric acid (GABA) is the most abundant inhibitory neurotransmitter in the mammalian central nervous system. GABA acts via two different classes of receptors, the GABAA receptors, which are Cl- channels that can be opened by GABA and the GABAB receptors, which are indirectly coupled to Ca2+ and K+ channels via second messenger systems. GABAA receptors are composed of five subunits that can belong to eight different subunit classes. The majority of receptors are composed of two α, two β and one γ subunits.
In addition to GABA, many drugs, such as benzodiazepines, barbiturates, steroids, anaesthetics, and convulsants, are able to bind to and thereby modulate the GABAA receptors. The exact molecular structure is still unknown, as it is the case for most receptors of the cys loop receptor super family. Aim of this thesis was to produce and purify large amounts of recombinant hetero oligomeric (alpha1 beta3 gamma2) GABAA receptors for subsequent structural analysis, such as crystallization, photo affinity labeling or surface plasmon resonance investigations.
For that, receptors with three different subunit compositions (α1β3His8γ2, α1β3γ2His8 and α1β3γ2His12) were expressed using the baculovirus expression system in Sf9 cells for large scale purification. The α1β3γ2His12 construct was cloned newly into a pBac4x 1 vector. After generating stable baculovirus stocks for all constructs, the best expression conditions were determined for each receptor type using [3H]muscimol and [3H]benzodiazepine binding studies. Degradation of the proteins was investigated by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, Coomassie blue staining and Western blot analysis. Purification of the receptors via their His tag using a Ni NTA column (and a benzodiazepine containing affinity column for the α1β3His8γ2 construct) provided dissimilar results. In a two step purification the α1β3His8γ2 receptor resulted in an estimated purity of 90% with little degradation of the subunits, but with a low yield. The α1β3γ2His8 and the α1β3γ2His12 receptors presented a reduced overall expression with degradation products of the subunits and thus the recovery was lower as for the α1β3His8γ2 receptor. Since a minimum of functional receptors in the membrane is needed for purification, the expressed α1β3His8γ2 construct with a two step purification will be used for further structural analysis.
Keywords (eng)
GABA receptorbaculovirus expression systemprotein purification
Keywords (deu)
GABAA RezeptorBaculovirus ExpressionssystemProteinreinigung
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1281671
Number of pages
112
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