Telomere sind die Enden eukaryotischer Chromosomen und bestehen aus repetitiver Guanin-reicher DNA Sequenz. Eine der wichtigsten Aufgaben von Telomeren ist sich von DNS Doppelstrangbrüchen zu unterscheiden und damit einhergehende, schädliche Fusionen der Chromosomenenden zu vermeiden. Außerdem können Telomere, deren Instandhaltung dereguliert ist, Krebserkrankungen veursachen und es scheint dass eine graduelle Verkürzung der Telomere mit ein Grund für Zellalterung darstellt. Die Telomerlänge variiert je nach Organismus von einigen hundert Basenpaaren bis zu mehreren Kilobasenpaaren. Das 3‘ Ende des Telomers geht über das 5‘ Ende hinaus und bildet einen G-reichen, einzelsträngigen Überhang. Dieser „G-Überhang“ (G-overhang) ist notwendig um eine „t-Schlinge“ (t-loop) zu formen. Der „G-Überhang“ dringt dabei in die telomerische DNS auf dem eigenen Chromosomenarm ein, und hilft das Chromosomenende vor DNS Reparaturaktivitäten zu schützen. Daher gilt der G-Überhang als essentieller Bestandteil eines Telomers.
Wir zeigen hier, dass ein Teil der Telomere der Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) keinen „G-Überhang“ besitzt. Mittels „dUTP-PENT“ Methode detektieren wir „G-Überhänge“ und mittels „hairpin ligation“ Methode identifizieren wir erstmals glatte oder nahezu glatte Telomere. Die terminale Permuation des glatten Endes - TTTAGGG-3‘ - wurde mittels „Next generation“ Sequenzierung ermittelt. Das glatte Telomerende wurde bisher in keinem anderen Organismus festgestellt. Es kann keine beschützende t-Schlinge formen und muss daher durch einen neuen, bisher unbekannten Mechanismus beschützt werden.
Um zu bestimmen, wie glatte Telomere beschützt werden, haben wir die Telomerstruktur verschiedener Mutanten untersucht, deren Schutzmechanismus für Chromosomenenden defekt ist. Diese Experimente haben gezeigt, dass die Deletion von STN1, ein „G-Überhang“ spezifisches Protein des CST Komplexes, keinen Effekt auf das glatte Ende hat. Im Gegensatz dazu hat die Deletion des DNS Bindungsproteins KU70/KU80 zur Folge, dass das glatte Ende verschwindet. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass die Exonuklease EXO1 hauptsächlich für die Resektion des ungeschützten glatten Endes veranwortlich ist.
Zusammenfassend zeigen wir, dass in Kontrast zu fundamentalen Konzepten der Telomerbiologie, „G-Überhänge“ für ein funktionstüchtiges Telomer nicht essentiell sind. Wir schlagen vor, dass glatte Telomere durch die Replikation des DNS Leitstranges entstehen und somit die beiden Enden eines Chromosoms asymmetrisch sind. Der Schutz des glatten Endes ist abhängig von Ku, denn in dessen Abwesenheit werden die glatten Enden in „G-Überhänge“ umgewandelt. Da Telomere in den meisten anderen Organismen symmetrisch sind, stellt die Ackerschmalwand ein einzigartiges Modell zur Aufklärung jener molekularen Mechanismen dar, die zur Entstehung symmetrischer Telomere führen.
Telomeres, the ends of eukaryotic chromosomes, are crucial for maintaining the integrity of genomic information. Telomeres protect chromosome ends from being recognized as DNA double strand breaks, which would lead to a strong DNA damage response and deleterious end-to-end fusions. Deregulated telomere maintenance is a hallmark of most cancers and telomere shortening has been suggested to be a cause of human aging. Depending on the organism, telomere length ranges from several hundred base pairs to several kilo base pairs of repetitive G-rich sequence. The most distal end of the telomere forms a 3’ single stranded DNA protrusion of the G-rich telomeric strand. This “G-overhang” is necessary for formation of the “t-loop”, where the G-overhang invades telomeric DNA at its own chromosome arm, thus creating a DNA loop that effectively hides the end of the chromosome from DNA repair factors. Thus, the G-overhang is thought to be essential for protecting chromosome ends from triggering a DNA damage response.
Here, we show that, surprisingly and contrary to major assumption in the field, a portion of telomeres in Arabidopsis do not possess a G-overhang. We developed two assays, one for quantifying the fraction of G-overhang containing telomeres (dUTP-PENT) and one for identifying telomeres with a blunt or near-blunt-end (hairpin ligation assay). Using these assays, we demonstrate that Arabidopsis has two populations of telomeres: G-overhang containing ends and blunt-ended telomeres. The terminal permutation of the blunt-end was determined by next-generation sequencing as TTTAGGG-3’. The discovery of blunt-ends is surprising as blunt-ended telomeres were never previously detected in any organism. These structures are unable to form t-loops, and must therefore employ a fundamentally novel mechanism for chromosome end capping which does not rely on G-overhangs.
In order to understand how the blunt-ended telomeres are protected, we studied the telomere structure in Arabidopsis mutants deficient in chromosome end protection. We demonstrate that deletion of STN1, which is a member of the G-overhang binding protein complex CST, has no effect on the blunt-end. In contrast, deletion of the DNA binding KU70/KU80 heterodimer results in loss of the blunt-end. Furthermore, we show that EXO1 is the nuclease primarily responsible for resecting the blunt-end in the absence of Ku.
In conclusion, this study demonstrates that, contrary to a fundamental concept in telomere biology, G-overhangs are dispensable for telomere function. We propose that blunt-ended telomeres are formed by leading strand replication and that each end of a chromosome assumes a different structural conformation. Protection of the blunt-end is dependent on Ku, as, in its absence, blunt-ends are converted into G-overhangs. As chromosomes in most other organisms are symmetric with regards to the distribution of the G-overhang, Arabidopsis offers a unique opportunity to study mechanisms that process blunt-ended telomeres, which are expected to temporarily appear after DNA replication in all organisms.
Telomere sind die Enden eukaryotischer Chromosomen und bestehen aus repetitiver Guanin-reicher DNA Sequenz. Eine der wichtigsten Aufgaben von Telomeren ist sich von DNS Doppelstrangbrüchen zu unterscheiden und damit einhergehende, schädliche Fusionen der Chromosomenenden zu vermeiden. Außerdem können Telomere, deren Instandhaltung dereguliert ist, Krebserkrankungen veursachen und es scheint dass eine graduelle Verkürzung der Telomere mit ein Grund für Zellalterung darstellt. Die Telomerlänge variiert je nach Organismus von einigen hundert Basenpaaren bis zu mehreren Kilobasenpaaren. Das 3‘ Ende des Telomers geht über das 5‘ Ende hinaus und bildet einen G-reichen, einzelsträngigen Überhang. Dieser „G-Überhang“ (G-overhang) ist notwendig um eine „t-Schlinge“ (t-loop) zu formen. Der „G-Überhang“ dringt dabei in die telomerische DNS auf dem eigenen Chromosomenarm ein, und hilft das Chromosomenende vor DNS Reparaturaktivitäten zu schützen. Daher gilt der G-Überhang als essentieller Bestandteil eines Telomers.
Wir zeigen hier, dass ein Teil der Telomere der Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) keinen „G-Überhang“ besitzt. Mittels „dUTP-PENT“ Methode detektieren wir „G-Überhänge“ und mittels „hairpin ligation“ Methode identifizieren wir erstmals glatte oder nahezu glatte Telomere. Die terminale Permuation des glatten Endes - TTTAGGG-3‘ - wurde mittels „Next generation“ Sequenzierung ermittelt. Das glatte Telomerende wurde bisher in keinem anderen Organismus festgestellt. Es kann keine beschützende t-Schlinge formen und muss daher durch einen neuen, bisher unbekannten Mechanismus beschützt werden.
Um zu bestimmen, wie glatte Telomere beschützt werden, haben wir die Telomerstruktur verschiedener Mutanten untersucht, deren Schutzmechanismus für Chromosomenenden defekt ist. Diese Experimente haben gezeigt, dass die Deletion von STN1, ein „G-Überhang“ spezifisches Protein des CST Komplexes, keinen Effekt auf das glatte Ende hat. Im Gegensatz dazu hat die Deletion des DNS Bindungsproteins KU70/KU80 zur Folge, dass das glatte Ende verschwindet. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass die Exonuklease EXO1 hauptsächlich für die Resektion des ungeschützten glatten Endes veranwortlich ist.
Zusammenfassend zeigen wir, dass in Kontrast zu fundamentalen Konzepten der Telomerbiologie, „G-Überhänge“ für ein funktionstüchtiges Telomer nicht essentiell sind. Wir schlagen vor, dass glatte Telomere durch die Replikation des DNS Leitstranges entstehen und somit die beiden Enden eines Chromosoms asymmetrisch sind. Der Schutz des glatten Endes ist abhängig von Ku, denn in dessen Abwesenheit werden die glatten Enden in „G-Überhänge“ umgewandelt. Da Telomere in den meisten anderen Organismen symmetrisch sind, stellt die Ackerschmalwand ein einzigartiges Modell zur Aufklärung jener molekularen Mechanismen dar, die zur Entstehung symmetrischer Telomere führen.
Telomeres, the ends of eukaryotic chromosomes, are crucial for maintaining the integrity of genomic information. Telomeres protect chromosome ends from being recognized as DNA double strand breaks, which would lead to a strong DNA damage response and deleterious end-to-end fusions. Deregulated telomere maintenance is a hallmark of most cancers and telomere shortening has been suggested to be a cause of human aging. Depending on the organism, telomere length ranges from several hundred base pairs to several kilo base pairs of repetitive G-rich sequence. The most distal end of the telomere forms a 3’ single stranded DNA protrusion of the G-rich telomeric strand. This “G-overhang” is necessary for formation of the “t-loop”, where the G-overhang invades telomeric DNA at its own chromosome arm, thus creating a DNA loop that effectively hides the end of the chromosome from DNA repair factors. Thus, the G-overhang is thought to be essential for protecting chromosome ends from triggering a DNA damage response.
Here, we show that, surprisingly and contrary to major assumption in the field, a portion of telomeres in Arabidopsis do not possess a G-overhang. We developed two assays, one for quantifying the fraction of G-overhang containing telomeres (dUTP-PENT) and one for identifying telomeres with a blunt or near-blunt-end (hairpin ligation assay). Using these assays, we demonstrate that Arabidopsis has two populations of telomeres: G-overhang containing ends and blunt-ended telomeres. The terminal permutation of the blunt-end was determined by next-generation sequencing as TTTAGGG-3’. The discovery of blunt-ends is surprising as blunt-ended telomeres were never previously detected in any organism. These structures are unable to form t-loops, and must therefore employ a fundamentally novel mechanism for chromosome end capping which does not rely on G-overhangs.
In order to understand how the blunt-ended telomeres are protected, we studied the telomere structure in Arabidopsis mutants deficient in chromosome end protection. We demonstrate that deletion of STN1, which is a member of the G-overhang binding protein complex CST, has no effect on the blunt-end. In contrast, deletion of the DNA binding KU70/KU80 heterodimer results in loss of the blunt-end. Furthermore, we show that EXO1 is the nuclease primarily responsible for resecting the blunt-end in the absence of Ku.
In conclusion, this study demonstrates that, contrary to a fundamental concept in telomere biology, G-overhangs are dispensable for telomere function. We propose that blunt-ended telomeres are formed by leading strand replication and that each end of a chromosome assumes a different structural conformation. Protection of the blunt-end is dependent on Ku, as, in its absence, blunt-ends are converted into G-overhangs. As chromosomes in most other organisms are symmetric with regards to the distribution of the G-overhang, Arabidopsis offers a unique opportunity to study mechanisms that process blunt-ended telomeres, which are expected to temporarily appear after DNA replication in all organisms.