Teil 1: Zilien oder Flagellen sind hochspezialisierte Organellen, die auf der Mehrzahl eukaryotischer Zellen zu finden sind und aus einem von der Plasmamembran umschlossenen Axonem bestehen. Diese Zellfortsätze spielen eine wichtige Rolle bei der zellulären Fortbewegung sowie in verschiedenen Signalkaskaden und konnten bereits mit diversen Erkrankungen in Verbindung gebracht werden. Eines meiner PhD Projekte beschäftigte sich mit der Klonierung und Aufreinigung von sechs verschiedenen Proteinen, die eine wichtige Rolle in funktionierenden Zilien spielen.
Essenziell für den Aufbau und die Instandhaltung von Zilien ist der sogenannte Intraflagellare Transport (IFT), ein bi-direktionaler Transport von ciliären Bestandteilen entlang des mikrotubulären Axonems. Dieser Transport wird von zwei großen Proteinkomplexen, IFT Komplex A und IFT Komplex B, durchgeführt.
Zu Beginn meines PhD-Studiums versuchte ich den IFT Komplex A (IFT-A), der für den retrograden Transport verantwortlich ist, zu klonieren und in einem eukaryotischen Expressionssystem zu überexprimieren. Die sechs verschiedenen Untereinheiten von IFT-A aus Trypanosoma brucei wurden in drei MultiBac Transfervektoren kloniert, welche speziell für die Amplifikation von mutliplen Genen geeignet sind. Die erfolgreich generierten Konstrukte wurden via einer Donor-Akzeptor in vitro Cre-loxP Rekombination fusioniert um zwei multi-Gen Expressionsvektoren zu generieren. Diese wurden darauffolgend mittels Tn7 Transposition in zwei MultiBac Plasmide integriert und für die Baculovirus-Produktion in Insektenzellen verwendet.
Die Expression aller sechs IFT-A Proteine in sowohl Sf9 als auch Hi-Five Inseketenzellen konnte mittels anti-6xHis Western Blot nachgewiesen werden. Leider konnten nur geringe Mengen des Komplexes isoliert werden und die Aufreinigung via Affinitätschromatographie war nicht zufriedenstellend. Zukünftige Studien werden sich auf eine Steigerung des Expressionslevels der rekombinanten Proteine und auf die Verbesserung der Aufreinigungstrategie fokussieren.

Teil 2: Das Zentriol ist ein konserviertes, mikrotubuläres Organell, welches für die Bildung von Zentrosomen und die Biogenese von Zilien verantwortlich ist. Fünf verschiedene Proteine, die für die Duplikation von Zentrosomen notwendig sind, wurden zuerst in Caenorhabditis elegans identifiziert, und ihre Homologe konnten später auch in anderen Spezies nachgewiesen werden.
Zwei dieser Proteine, SAS-5 und SAS-6, interagieren direkt miteinander und sind voneinander abhängig um zu den Prozentriolen lokalisieren zu können. Wie diese beiden Proteine miteinander interagieren und warum das Zentriol in C. elegans eine einzigartige tubuläre Zentralstruktur besitzt, welche nur in Nematoden zu finden ist, konnte bisher noch nicht geklärt werden.
In folgender Studie zeige ich, dass die C-terminale Domäne von SAS-5 (CTD, Aminosäuren 390-404) spezifisch in der zentralen Region der SAS-6 Coiled-coil Domäne (Aminosäuren 275-289) bindet. Um ihre Interaktion genauer zu untersuchen habe ich die Kristallstruktur der Coiled-coil Domäne von SAS-6 (CCD, Aminosäuren 248-410) gelöst und gezeigt, dass die Bindung von SAS-6 CCD und SAS-5 CTD auf hydrophoben und elektrostatischen Wechselwirkungen basiert. Weiters besitzt die Kristallstruktur von SAS-6 CCD eine periodische Ladungsverteilung entlang des Coiled-coils, wodurch das Protein in der Abwesenheit von SAS-5, ein antiparalleles Tetramer bildet. Elektonenmikroskopische Studien des SAS-5/SAS-6 Komplexes implizieren, dass SAS-5 zirkulär an SAS-6 bindet und so die zentrale Röhrenstruktur der C.elegans Zentriolen bildet. Interessanterweise formt SAS-5, dass ohne SAS-6 aufgereinigt wird, Aggregate.
Zusammengenommen zeigen die vorliegenden Ergebnisse die molekulare Grundlage der spezifischen SAS-5/SAS-6 Interaktion, und legen nahe, dass beide Proteine in der Abwesenheit des jeweils anderen selbst-assoziierte Konformationen einnehmen. Diese werden erst durch die Bildung des Heterokomplexes SAS-5/SAS-6 aufgelöst, so dass ein korrekter Aufbau des Zentriols ermöglicht wird.

Part 1: Cilia and flagella are specialized organelles present in most eukayotic cells and consist of a membrane-sheathed axoneme and about 700 associated proteins. These organelles play im-portant roles in cell motility and/or signal transduction and have recently been associated with a plethora of human disorders. One of my PhD projects focused on the cloning and probably structural studies of a few proteins and their complexes that are essential for ciliogenesis.
Devoid of ribosomes and membrane-bound vesicles, cilia and flagella are assembled and main-tained by intraflagellar transport (IFT), which is a bidirectional transport process along the mi-crotubules of the axoneme. I started my PhD study trying to clone and over-express the IFT complex A (IFT-A), which is responsible for the retrograde transport in cilia. The six IFT-A genes were successfully cloned into three different MultiBac transfer vectors specifically designed for multi-gene amplification. These constructs were fused using Donor-Acceptor in vitro Cre-loxP recombination to generate two multi-gene expression constructs, which later were integrated into two MultiBac plasmids using Tn7 transposition for baculovirus production in insect cells. Expressions of all six IFT-A proteins in both Sf9 and Hi-Five insect cells were confirmed by anti-6×His western blot. However, the yield was low and purification by Ni-NTA proved not very suc-cessful. Future plans are both to increase the yield of co-expressed proteins and to refine puri-fication strategies.

Part 2: The centriole is a conserved microtubule-based organelle essential for both centrosome for-mation and cilium biogenesis. Five centriolar proteins have been identified in Caenorhabditis elegans and their homologues in other species have also been reported. Two of them, SAS-5 and SAS-6, physically interact with each other and are codependent for their targeting to procentrioles. However, it remains unclear how these two proteins interact at the molecular level and why the C. elegans centriole has a unique central tube that is absent in non-nematode centrioles. Here, I demonstrate that the SAS-5 C-terminal domain (CTD, residues 390-404) spe-cifically binds to the central region (residues 275-289) of the SAS-6 coiled coil. To further inves-tigate their interaction, I have solved the crystal structure of the SAS-6 coiled coil domain (CCD, residues 248-410) and established that the association of the SAS-6 CCD and the SAS-5 CTD is mediated by synergistic hydrophobic and electrostatic interactions. The crystal structure also shows a periodic charge pattern along the SAS-6 CCD which, in the absence of SAS-5, gives rise to an anti-parallel tetramer of its CCD. Electron microscopy studies of the SAS-5/SAS-6 complex suggest that the central tube of C. elegans centrioles is formed by SAS-5 circularly arranged on SAS-6; SAS-5 alone forms aggregates. We further show that mutations of key residues within the CCD disrupt SAS-6 recruitment and function in centriole assembly in vivo. Overall our find-ings establish the molecular basis of the specific interaction between SAS-5 and SAS-6, and sug-gest that both proteins individually adopt a self-associated conformation that is disrupted upon the formation of the hetero-complex to facilitate the correct assembly of the nine-fold symmet-ric centriole.