Characterization of MPB2C : a regulator of cell-to-cell transport via plasmodesmata

Nikola Winter

doi:10.25365/thesis.24279

You are here: University of Vienna PHAIDRA Detail o:1293730

Title (eng)

Characterization of MPB2C

a regulator of cell-to-cell transport via plasmodesmata

Parallel title (deu)

Charakterisierung von MPB2C, einem Protein, das den interzellulären Transports via Plasmodesmen reguliert

Author

Nikola Winter

Advisor

Friedrich Kragler

Assessor

David Jackson

Christian Luschnig

Abstract (deu)

MPB2C (MOVEMENT PROTEIN BINDING PROTEIN 2C) ist ein pflanzenspezifisches, Mikrotubuli-assoziiertes Protein, das, wenn es überexprimiert wird, den interzellulären Transport zweier sehr unterschiedlicher Faktoren spezifisch verhindert: Es sind dies einerseits das Tabakmosaikvirus Movement Protein (TMV MP), das für die Ausbreitung der viralen Infektion in der Pflanze verantwortlich ist, und andererseits der Transkriptionsfaktor KNOTTED1 (KN1), der eine wichtige Rolle in der Stammzellbildung und -erhaltung spielt. TMV MP und KN1 vermitteln spezifisch ihren eigenen Transport in benachbarte Zellen über Plasmodesmen, indem sie das Größenausschlusslimit dieser dynamischen membranösen interzellulären Verbindungskanäle zwischen Pflanzenzellen temporär vergrößern. Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion von MPB2C in einem entwicklungsspezifischen Zusammenhang zu charakterisieren und so Einsicht in die Rolle des direkten interzellulären Transports von Homöodomänenproteinen zu erlangen. Dazu wurden Pflanzen mit veränderten Expressionsmengen oder –domänen von MPB2C hergestellt und untersucht. Die endogene Expressionsdomäne von MPB2C in Arabidopsis überlappt mit jener des nicht-zellautonomen Homöodomänenproteines STM und grenzt an die Expressionsdomäne von KNAT1/BP in vegetativen und reproduktiven Apikalmeristemen, im Gynoeceum und der Bruchzone zwischen Früchten und Blütenstielen. Das bekräftigt die Hypothese, dass MPB2C in planta an der Regulation des direkten interzellulären Transports dieser Transkriptionsfaktoren beteiligt ist. Die Interaktion zwischen MPB2C und diesen Proteinen wurde durch bimolekulare Fluoreszenz- Komlementation bestätigt. MPB2C wird aber auch in anderen Geweben (z.B. in Wurzelspitzen) exprimiert, was weitere endogene Funktionen von MPB2C nahelegt, welche über die Interaktion mit STM und KNAT1/BP hinausgehen. Es wurden verschiedene transgene Pflanzenlinien etabliert, die MPB2C überexprimieren, und mit zwei verschiedenen Methoden wurde versucht, silencing Linien zu etablieren. Weiters wurden zwei Punktmutanten und eine T-DNA Insertionslinie untersucht. Es konnte jedoch keine MPB2C Knockout-Linie bestätigt oder etabliert werden; das könnte darauf hindeuten, dass MPB2C essentiell ist und daher Knockout-Pflanzen nicht überlebensfähig sind. Gelegentlich zeigten einzelne transgene Pflanzen mit veränderter MPB2C Expression phänotypische Veränderungen, die auf eine gestörte Stammzellhomöostase oder beeinträchtigte Funktion von Homöodomänenproteinen hinweisen. Ein Überexpressionskonstrukt löste einen Phänotyp aus, welcher der knat1/bp Mutante ähnelt. Das zeigt, dass MPB2C nicht nur in Meristemen sondern auch in differenzierteren Geweben an der Regulation von Homeodomänproteinen beteiligt ist. Die regulatorischen Mechanismen im Stammzellbereich direkt scheinen sehr robust zu sein, und sie sind redundant, sodass die Fehlfunktion einer Komponente großteils kompensiert werden kann. MPB2C unterliegt in Zellaufschlüssen dem proteosomalen Abbau. Eine Verbindung zum Proteasom-vermittelten Abbau könnte KNB1 liefern. KNB1 ist ein nicht charakterisiertes Protein, das mit MPB2C und mit den Homöodomänenproteinen STM und KNAT1/BP interagiert. In unserem Arbeitsmodell moduliert MPB2C gemeinsam mit KNB1 die Funktion von STM und KNAT1/BP, indem sie deren Verfügbarkeit für den interzellulären Transport beeinflussen.

Abstract (eng)

MPB2C (MOVEMENT PROTEIN BINDING PROTEIN 2C) is a plant-specific, microtubules-associated protein that was shown to specifically interfere with the cell to cell movement of two very different factors: the Tobacco mosaic virus movement protein (TMV MP) essential for the spread of viral infection, and the homeodomain transcription factor KNOTTED1 (KN1) which is involved in stem cell initiation and maintenance. TMV MP and KN1 are able to specifically facilitate their own transport into neighboring cells via plasmodesmata by temporary altering the size exclusion limit of these dynamic membranous channels that connect plant cells. The aim of this study was to characterize the function of MPB2C in a developmental context and to gain insight into the significance of homeodomain protein cell-to-cell movement by analyzing plants overexpressing, misexpressing or lacking MPB2C. The endogenous expression domain of MPB2C in Arabidopsis overlaps with or flanks the expression domains of genes encoding non-cell autonomous homeodomain proteins, STM and KNAT1/BP, respectively, in the vegetative and inflorescence shoot apical meristems, in gynoecia and in the abscission zone of siliques. This strongly supports the hypothesis of MPB2C being involved in regulation of cell-to-cell transport of these transcription factors in planta. Interaction of MPB2C with these proteins was confirmed by bimolecular fluorescence complementation. Yet MPB2C is also expressed in other tissues, which suggests a broader scope of MPB2C function beyond the interaction with STM and KNAT1/BP. Various transgenic plant lines were established that ectopically overexpress MPB2C, and two different methods were applied in attempts to create MPB2C silencing lines. Furthermore two MPB2C point mutants and a T-DNA insertion line were analyzed. No MPB2C knock-out lines could be confirmed or established; this could indicate that MPB2C is an essential factor for plant growth. Occasional phenotypic alterations indicating altered stem cell homeostasis or homeodomain protein function in plants with modified MPB2C expression were observed. With one MPB2C overexpression construct plants resembling knat1/bp mutants were obtained. This shows that MPB2C function is important in the regulation of homeodomain proteins beyond meristems in more differentiated tissues as well. The regulatory processes in stem cell domains seem to be robust and they are redundant, hence the malfunction of one component might be largely balanced by others. The MPB2C protein was shown to be prone to degradation in native cell extracts, but it could be stabilized by adding proteasome inhibitors. A link to proteasomal degradation might be provided via KNB1, a novel protein that interacts with MPB2C and the homeodomain proteins STM and KNAT1/BP. In our working model MPB2C, with the help of KNB1, regulates STM and KNAT1 protein levels and their availability for intercellular transport.

Keywords (eng)

MPB2CKNOTTED1STMKNAT1KNB1plasmodesmataNCAPs

Keywords (deu)

MPB2CSTMKNAT1KN1KNB1Plasmodesmen

Subject (deu)

Subject (deu)

Subject (deu)

Subject (deu)