Title (eng)
Biochemical analysis of an in vivo immunoprecipitation complex of the prion protein
Parallel title (deu)
Biochemische Analyse eines in vivo Immunopräzipitationskomplexes
Author
Arlind Adili
Advisor
Johannes Berger
Assessor
Johannes Berger
Abstract (deu)
Das Prion-Protein (PrPC) ist ein Glykosyl-Phosphatidylinositol-verankertes Membranprotein, welches durch Konformationsänderung zur beta-Faltblatt-reichen und proteaseresistenten Skrapie-Isoform (PrPSc) zum Auslöser der transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSE) werden kann. Die physiologische Funktion von PrP bleibt hingegen weitgehend unbekannt. PrP-Expression und Verankerung an der Zellmembran sind für die Entwicklung der Pathologie unerlässlich. In zahlreichen Arbeiten wurde die Rolle von PrP in Signaltransduktionswegen anhand von direkten Protein-Protein Interaktionen untersucht. Durch Immunpräzipitation mithilfe der monoklonalen Antikörper POM2 wurde für diesen Zweck ein in vivo Immunpräzipitationskomplex (IP-Komplex) isoliert, welcher anschliessend mittels synthetischer Peptide spezifisch für die POM2-Bindungsstelle eluiert wurde. Durch native Gele und Gel-Permeations-Chromatographie (GPC) wurde die Grösse des IP-Komplexes (800kD) bestätigt. Anschliessende massenspektroskopische Analysen deuteten eine Beteiligung mehrerer Proteine im Komplex an.
In dieser Studie habe ich versucht die Interaktion der Kandidatenproteine mit PrP im IP-Komplex mithilfe des Western Blotting nachzuprüfen. Eine spezifische Interaktion konnte bis jetzt nicht bewiesen werden. Ausserdem konnte nach der Silberfärbung unter denaturierenden Bedingungen im SDS-PAGE Gel nur eine einzige Bande nachgewiesen werden, die der Grösse des PrP selbst entspricht und praktisch die Präsenz anderer Proteine ausschliesst. Kontrollexperimente mit monomerem detergenzfrei aufgereinigtem bPrP zeigten, dass die 800kD Bande nicht infolge der beeinträchtigten elektrophoretischen Migration entstanden ist. Zusätzlich haben in vitro Experimente unter Einsatz von chemischen Crosslinkern nahegelegt, dass PrP in multimeren Clustern an der Zelloberfläche vorkommen könnte.
Zusammenfassend weisen diese Ergebnisse auf eine homotypische Interaktion des zellulären PrP hin, die möglicherweise für die Ausübung der physiologischen Funktion von Bedeutung ist. Anderseits könnte eine Unterbrechung der physiologischen Signaltransduktion zu Neurotoxizität führen, worauf genetische Ablationen bereits hindeuten. Die Erkenntnis der multimeren Organisation von PrP könnte helfen die Physiologie und viel wichtiger die Aktivierung der pathologischen Vorgänge besser zu verstehen.
Abstract (eng)
The prion protein is a cell surface GPI-anchored protein, best known for causing transmissible spongiform encephalopathies (TSE) when conformationally converted into its protease resistant and beta-sheet rich scrapie form (PrPSc). Its physiological function remains largely unknown, however its expression and membrane anchoring is indispensable for the development of TSEs. Numerous biochemical efforts have been made recently to address PrP’s involvement in signaling pathways, by testing direct protein-protein interactions of PrP. To this end, an in vivo immunoprecipitation (IP) complex was isolated using mouse monoclonal antibodies (POM2) and eluted with synthetic peptides specific for the POM2 binding region. Native gels (and size-exclusion chromatography) revealed a high-molecular weight complex of approximately 800kD. Subsequent mass spectrometry analyses suggested the presence of multiple proteins in this complex.
Here, I tried to verify the interaction of the candidate proteins with PrP in the complex via Western blotting. So far, no specific interaction could be verified. In addition, silver staining under denaturing conditions revealed a single band on a SDS-PAGE corresponding to PrP, suggesting an absence of other proteins/peptides in the complex. Control experiments with monomeric detergent-free purified and phospholipase-cleaved bovine PrP further confirmed that the HMW band is not a mere electrophoretic migration artifact. Furthermore, chemical cross linking with cell impermeable agents in cell culture yielded multiple band shifts, potentially indicating a multimeric organization of PrP at the cell surface.
Taken together, these results suggest that there is a homotypic interaction of cellular PrP, which might be necessary for exerting its physiological function in signal transduction. Conversely, a disruption of this type of interaction might subvert PrP-mediated signal transduction thus causing severe neurotoxicity reminiscent of the phenotype resulting from genetic ablation of the central domain. In summary, the multimeric organization of PrP might provide new insights in understanding PrP physiology and more importantly help to better understand the initiation of toxic events in prion-mediated pathologies.
Keywords (eng)
prionprion protein/ Immunoprecipitation/ Immunoblottingprotein-protein interaction
Keywords (deu)
Prion-ProteinPrionImmunopräzipitationProtein-Protein InteraktionWestern blotting
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1293836
rdau:P60550 (deu)
72 S.
Number of pages
72
Association (deu)
Title (eng)
Biochemical analysis of an in vivo immunoprecipitation complex of the prion protein
Parallel title (deu)
Biochemische Analyse eines in vivo Immunopräzipitationskomplexes
Author
Arlind Adili
Abstract (deu)
Das Prion-Protein (PrPC) ist ein Glykosyl-Phosphatidylinositol-verankertes Membranprotein, welches durch Konformationsänderung zur beta-Faltblatt-reichen und proteaseresistenten Skrapie-Isoform (PrPSc) zum Auslöser der transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSE) werden kann. Die physiologische Funktion von PrP bleibt hingegen weitgehend unbekannt. PrP-Expression und Verankerung an der Zellmembran sind für die Entwicklung der Pathologie unerlässlich. In zahlreichen Arbeiten wurde die Rolle von PrP in Signaltransduktionswegen anhand von direkten Protein-Protein Interaktionen untersucht. Durch Immunpräzipitation mithilfe der monoklonalen Antikörper POM2 wurde für diesen Zweck ein in vivo Immunpräzipitationskomplex (IP-Komplex) isoliert, welcher anschliessend mittels synthetischer Peptide spezifisch für die POM2-Bindungsstelle eluiert wurde. Durch native Gele und Gel-Permeations-Chromatographie (GPC) wurde die Grösse des IP-Komplexes (800kD) bestätigt. Anschliessende massenspektroskopische Analysen deuteten eine Beteiligung mehrerer Proteine im Komplex an.
In dieser Studie habe ich versucht die Interaktion der Kandidatenproteine mit PrP im IP-Komplex mithilfe des Western Blotting nachzuprüfen. Eine spezifische Interaktion konnte bis jetzt nicht bewiesen werden. Ausserdem konnte nach der Silberfärbung unter denaturierenden Bedingungen im SDS-PAGE Gel nur eine einzige Bande nachgewiesen werden, die der Grösse des PrP selbst entspricht und praktisch die Präsenz anderer Proteine ausschliesst. Kontrollexperimente mit monomerem detergenzfrei aufgereinigtem bPrP zeigten, dass die 800kD Bande nicht infolge der beeinträchtigten elektrophoretischen Migration entstanden ist. Zusätzlich haben in vitro Experimente unter Einsatz von chemischen Crosslinkern nahegelegt, dass PrP in multimeren Clustern an der Zelloberfläche vorkommen könnte.
Zusammenfassend weisen diese Ergebnisse auf eine homotypische Interaktion des zellulären PrP hin, die möglicherweise für die Ausübung der physiologischen Funktion von Bedeutung ist. Anderseits könnte eine Unterbrechung der physiologischen Signaltransduktion zu Neurotoxizität führen, worauf genetische Ablationen bereits hindeuten. Die Erkenntnis der multimeren Organisation von PrP könnte helfen die Physiologie und viel wichtiger die Aktivierung der pathologischen Vorgänge besser zu verstehen.
Abstract (eng)
The prion protein is a cell surface GPI-anchored protein, best known for causing transmissible spongiform encephalopathies (TSE) when conformationally converted into its protease resistant and beta-sheet rich scrapie form (PrPSc). Its physiological function remains largely unknown, however its expression and membrane anchoring is indispensable for the development of TSEs. Numerous biochemical efforts have been made recently to address PrP’s involvement in signaling pathways, by testing direct protein-protein interactions of PrP. To this end, an in vivo immunoprecipitation (IP) complex was isolated using mouse monoclonal antibodies (POM2) and eluted with synthetic peptides specific for the POM2 binding region. Native gels (and size-exclusion chromatography) revealed a high-molecular weight complex of approximately 800kD. Subsequent mass spectrometry analyses suggested the presence of multiple proteins in this complex.
Here, I tried to verify the interaction of the candidate proteins with PrP in the complex via Western blotting. So far, no specific interaction could be verified. In addition, silver staining under denaturing conditions revealed a single band on a SDS-PAGE corresponding to PrP, suggesting an absence of other proteins/peptides in the complex. Control experiments with monomeric detergent-free purified and phospholipase-cleaved bovine PrP further confirmed that the HMW band is not a mere electrophoretic migration artifact. Furthermore, chemical cross linking with cell impermeable agents in cell culture yielded multiple band shifts, potentially indicating a multimeric organization of PrP at the cell surface.
Taken together, these results suggest that there is a homotypic interaction of cellular PrP, which might be necessary for exerting its physiological function in signal transduction. Conversely, a disruption of this type of interaction might subvert PrP-mediated signal transduction thus causing severe neurotoxicity reminiscent of the phenotype resulting from genetic ablation of the central domain. In summary, the multimeric organization of PrP might provide new insights in understanding PrP physiology and more importantly help to better understand the initiation of toxic events in prion-mediated pathologies.
Keywords (eng)
prionprion protein/ Immunoprecipitation/ Immunoblottingprotein-protein interaction
Keywords (deu)
Prion-ProteinPrionImmunopräzipitationProtein-Protein InteraktionWestern blotting
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1293837
Number of pages
72
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