Cannabinoide sind die aktiven Inhaltsstoffe der Cannabispflanze Cannabis sativa L.. Diese aus der Pflanze stammenden Phytocannabinoide wurden, besonders aufgrund ihrer psychoaktiven Eigenschaften, schon vor hunderten von Jahren in der Medizin angewandt. In den vergangen Jahren wurden diverse synthetischen Cannabinoide mit ähnlicher Wirkung entwickelt. Sie üben ihre Funktion aus indem sie als Agonist, Antagonist oder inverser Agonist an die zwei Cannabinoidrezeptoren CNR1 und CNR2 binden. Dabei wird CNR1 hauptsächlich im Nervensystem exprimiert, während man CNR2 meist im Immunsystem findet. In der Klinik werden Cannabinoide bereits gegen Übelkeit und Erbrechen bei Chemotherapiepatienten und zur Appetitstimulation von AIDS Patienten eingesetzt. Zudem wurde in verschiedenen Studien die Wirkung von Cannabinoiden bei soliden Tumoren beschrieben. Sie inhibieren Apoptose, Zellproliferation, Invasion, Metastase und blockieren Angiogenese. Ähnliche anti-proliferative Wirkungen wurden auch bei non-Hodgkin Lymphomen beobachtet. Chronische lymphatische Leukämie (CLL) ist ein solches non-Hodgkin Lymphom und die häufigste Leukämie bei Erwachsenen in westlichen Ländern. Der klinische Verlauf ist sehr heterogen. Die Standardtherapie besteht aus Chemo- oder Immuno-chemotherapie. Ein Drittel der Patienten reagiert jedoch nicht auf die Behandlung, und erliegt nach schneller Progression der Erkrankung. Obwohl in den vergangen Jahren große Fortschritte in der Entwicklung von Therapien gemacht wurden, werden für die Hoch-Risiko-Patienten neue Therapiemöglichkeiten dringend benötigt. Daher und wegen der berichteten cytotoxischen Effekte der Cannabinoide, wollten wir die Cannabinoidrezeptoren und ihre Liganden in der CLL genauer studieren. Eine Kohorte von 102 gut charakterisierten Patienten wurde in einer real time PCR auf CNR1 und CNR2 mRNA Expression untersucht. Die Expression wurde relative zum Mittelwert von CD19 sortierten gesunden Zellen berechnet. Zudem wurde in ausgewählten Proben die Proteinexpression analysiert. Um den cytotoxischen Effekt nachzuweisen, wurden Zelllinien und mononukleare Zellen des periphären Bluts (PBMC) von gesunden Probanden und CLL Patienten mit Cannabinoiden in verschiedenen Konzentrationen inkubiert und mit Fludarabin verglichen. Die IC50 Werte wurden basierend auf Standardviabilitätstests kalkuliert. Beide Cannabinoidrezeptoren waren in der Studienkohorte überexprimiert. Während die CNR2 mRNA Expression mit keinem prognostischen Marker korrelierte, war eine hohe CNR1 Expression mit einem fortgeschrittenen Binet Stadium (p-Wert0,049), unmutiertem IGHV (p-Wert0,006) und erhöhter CD38 Expression (p-Wert0,032), assoziiert. Zudem zeigten CNR1 hoch exprimierende Patienten ein kürzeres Gesamtüberleben (p-Wert0,002) und behandlungsfreies Überleben (p-Wert0,000). Die Porteinexpression konnte nicht analysiert werden, da die kommerziell erhältlichen Antikörper sich als nicht spezifisch für CNR1 und CNR2 herausstellten. Bei der Inkubation der Tumorzelllinien MEC-1, MEC2 (beide CLL), JURKAT (T-Zell akut Leukämie) und A-549 (Lungenkarzinom) mit (R)-(+)-Methandamide, ACEA, (-)-Cannabidiol, JWH133, AM251 und AM630 mit verschiedenen Konzentrationen, konnte eine zeit- und konzentrationsabhängige Abnahme der Zellviabilität gezeigt werden. Zudem reagierten die Zelllinien, unterschiedlich sensibel, was nicht mit der mRNA Expression des CNR1 und CNR2 assoziiert war. Danach wurden die PBMC von CLL Patienten in Suspension- und in einem Cokulturmodell mit der Maus Fibroblasten Zelllinie M2-10B4 mit den Substanzen inkubiert. In dem Suspensionsmodell, zeigten die primären CLL Zellen eine ähnliche Anfälligkeit gegen ACEA, eine geringere gegen JWH133 und (-)-Cannabidiol und eine höhere Sensitivität gegen die anderen drei Cannabinoide. Das Cokulturmodell zeigte einen protektiven Effekt für die Cannabinoidinkubation, außer bei (R)-(+)-Methandamide und (-)-Cannabidiol. Diese hatten ebenfalls einen toxischen Effekt auf die M2-10B4. Außer (R)-(+)-Methandamide, hatten die Cannabinoide einen ähnlichen toxischen Effekt auf die gesunden Zellen. Im letzten Teil der Studie wurde das Mikroumfeld, besonders die CXCR4/CXCL12 Interaktion untersucht. Diese trägt zum Überleben von Leukämie Zellen bei und Cannabinoide wurden beschrieben, diese Interaktion in T-Zellen zu stören. Daher wurde der additive Effekt von Cannabinoiden mit Fludarabin untersucht und mit der Wirkung von AMD3100, einem CXCR4 Inhibitor, verglichen. Es zeigte sich, dass Cannabinoide, im Vergleich zu AMD3100, einen geringeren Einfluss auf die Zellviabilität und nur einen geringen additiven Effekt mit Fludarabin hatten. Zuletzt wurde die Wirkung von Cannabinoiden auf die Migration von CLL Zellen, die CXCR4 exprimieren, zu CXCL12 getestet. Im Gegensatz zu AMD3100, hatten die Cannabinoide keinen signifikanten inhibierenden Einfluss auf die Migration. Bezogen auf den geringen Einfluss der Cannabinoide auf das Mikroumfeld in Bezug auf Überleben und Migration, sowie der ähnlichen toxischen Wirkung auf CLL und gesunde Zellen, scheinen Cannabinoide keine vielversprechende therapeutische Substanz in der CLL darzustellen. Obwohl die CNR2 Expression keinen prognostischen Wert ergab, konnten die CNR1 mRNA Expression als neuer prognostischer Marker gezeigt werden.

Cannabinoids are the active compounds of the marijuana plant Cannabis sativa L. For hundreds of years, these plant derived phytocannabinoids have been used for medical indications, in particular for their psychoactive properties, and a number of synthetic cannabinoids with similar activity have been developed in recent years. They exert their function by binding the two cannabinoid receptors, CNR1 and CNR2, as agonist, antagonist or inverse agonist. Of the two receptors, CNR1 is mostly expressed in the nervous while CNR2 mainly is found in the immune system. Clinical applications for cannabinoids are, for instance, the suppression of nausea and vomiting in patients during chemotherapy, or the stimulation of appetite in AIDS patients. In addition, various studies reported that cannabinoids induce apoptosis and inhibit cell proliferation, invasion, and metastasis and block angiogenesis in solid tumors. Similar antiproliferative effects were observed in non-Hodgkin lymphomas. Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is a non-Hodgkin lymphoma and the most prevalent leukemia of adults in Western countries. The clinical course is heterogeneous, and standard therapeutic regimens consist of chemo- or immuno-chemotherapy. But one third of patients never responds to treatment, progress rapidly and succumbs to the disease. Great progress has been made in the development of therapeutics in recent years. However, in particular for these high risk patients novel therapeutic options are urgently needed. Considering the cytotoxic effects reported for cannabinoids and the need for therapeutic drugs in CLL, we wanted to study the cannabinoid receptors and the effect of their ligands in this malignancy in more detail. A cohort of 102 well characterized patients was screened by real time PCR for CNR1 and CNR2 mRNA expression. Expression was calculated relative to the mean of CD19 sorted healthy cells. Protein expression was analyzed in selected samples. Cell lines and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from CLL patients and healthy donors were incubated with cannabinoids in different concentrations and in comparison to fludarabine to establish cytotoxic efficacy. IC50 values were calculated based on standard viability assays. Both cannabinoid receptors were over-expressed in the study cohort. Whereas CNR2 mRNA expression did not correlate with any bad prognostic marker, high CNR1 mRNA expression was associated with advanced Binet stage (p-value0,049), unmutated IGHV (p-value0,006) and high CD38 expression (p-value0,032). Furthermore, CNR1 high expressing patients had a shorter overall survival (p-value0,002) and treatment free survival (p-value0,000). Protein expression levels could not be analyzed, due to the lack of specificity of the commercially available CNR1 and CNR2 antibodies. In a first step, the tumor cell lines MEC-1, MEC-2 (both CLL), JURKAT (T-cell acute leukemia), and A-549 (lung carcinoma) were incubated with R-(+)-Methanandamide, ACEA, (-)-Cannabidiol, JWH133, AM251, and AM630 at different concentrations. In these cell lines, a time and dose dependent decrease in cell viability could be determined. Differences in sensitivity between cell lines was observed, which were, however, not associated with CNR1 and CNR2 mRNA expression levels. Next, PBMC from CLL patients were incubated with the compounds both in suspension and in a pre-clinical, coculture model using the mouse fibroblast cell line M2-10B4. In suspension, comparing the CLL with the cell lines MEC-1 and MEC-2, the primary cells were similar susceptible to ACAE, less for JWH133 and (-)-Cannabidiol and more affected by the other three compounds. The coculture with the feeder cells exerted a protective effect, except for the incubation with (R)-(+)-Methanandamide and (-)-Cannabidiol. These two compounds had also a toxic effect on the M2-10B4 cells. Similar cytotoxic effects of the tested cannabinoids were observed in healthy donor PBMC except for R-(+)-Methanandamide. Finally, emphasize was put on the microenvironment, particular the CXCR4/CXCL12 axis, which has been shown to contribute to survival of leukemic cells. Cannabinoids have been implicated in interfering with this chemokine axis in T cells. Therefore the additive effect of cannabinoids with fludarabine was explored and compared to the impact of AMD3100, a CXCR4 targeting compound with experimental usage in therapy. In inhibiting cell viability, cannabinoids were less effective compared to AMD3100 and exerted only a small additive effect when tested in combination with fludarabine. Finally, the effect of cannabinoids on the migration of CLL cells, expressing the CXCR4, toward the CXCL12 ligand was evaluated. In contrast to AMD3100, the cannabinoids did not exert a significant inhibiting effect on the migration of the primary CLL cells towards CXCL12. Referring to the low impact of cannabinoids on microenvironment in survival and migration and the similar cytotoxic effect on CLL cells and healthy cells, cannabinoids seem to be a poor therapeutic substance in CLL. Although the mRNA expression of CNR2 is not of prognostic value, the CNR1 mRNA expression levels could be established as new prognostic marker.