Der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) ist ein wichtiger Regulator der Selbsterneuerung und Differenzierung von Zellen der Epidermis und wird häufig in hohen Konzentrationen in einer Vielzahl von epithelialen Tumoren exprimiert. Das Plattenepithelkarzinom im Kopf-Hals-Bereich ist eine bestimmte Krebsart, in der der EGFR in bis zu 100% der Fälle überexprimiert wird. Diese Art von Krebs ist der sechsthäufigste bösartige Tumor weltweit und verantwortlich für etwa 350.000 Todesfälle pro Jahr. Aufgrund der Deregulierung des EGFR-Signalwegs in Vorstufen von Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs, ist er ein bevorzugter Ansatzpunkt für neuartige Therapien mit einem breiten Spektrum an Inhibitoren, die derzeit untersucht werden. Cetuximab, ein monoklonaler Antikörper, der die EGFR Dimerisierung verhindert, wurde durch die „Food and Drug Administration“ (FDA) genehmigt und erfolgreich in der Behandlung gegen Krebs eingesetzt. Viele Patienten sprechen anfänglich gut auf das Medikament an, entwickeln jedoch im weiteren Behandlungsverlauf eine Resistenz, was schließlich zu Rückfällen führt. Daher ist es notwendig, die Mechanismen, die zur erworbenen Resistenz führen sowie die Strategien, diese zu überwinden, besser zu verstehen. Für diese Arbeit wurden zwei Plattenepithelkarzinom-Zelllinien, eine Kopf- und Hals-Karzinom-Zelllinie (HNSCC22) sowie eine epidermale Plattenepithelkarzinom-Zelllinie (SCC13) induziert, um eine Resistenz gegen Cetuximab zu entwickeln. Anschließend wurden die molekularen Veränderungen der Zelllinien, die mit dem Verlust der Cetuximab-Sensitivität einhergehen, charakterisiert. Es wurde kein erhöhtes Spätstadium von Apoptose in Cetuximab-sensitiven Zelllinen bei Einwirkung des Medikamentes für 48 h nachgewiesen. Eine quantitative Proliferationsanalyse zeigte einen signifikanten Rückgang nach der Exposition gegenüber Cetuximab für 48 h in der Zelllinie SCC13 S. Zudem führte die Behandlung mit Cetuximab zu einer Dosis-abhängigen Verringerung der Phosphorylierung der extrazellulär-signalregulierten Kinasen 1 und 2 (ERK1/2) in den Cetuximab-sensitiven Zelllinien, wohingegen kein Effekt in Cetuximab-resistenten Zelllinen sichtbar war. Darüber hinaus erhielten alle Zelllinien ihr proliferatives Potential in vivo, obwohl keine signifikanten Unterschiede in der Größe der orthotopen Tumoren von sensitiven und resistenten Zelllinien festgestellt werden konnte. Die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) zeigte, dass es keine Unterschiede in der globalen DNA Methylierung zwischen den sensitiven und resistenten Zellen gab. Jedoch konnten Änderungen in der Expression verschiedener Chromatin-Remodellierungs-Faktoren sowie von Genen, die im VEGF Signalweg beteiligt sind, nachgewiesen werden. Überraschenderweise zeigte eine gleichzeitige Behandlung mit Cetuximab und VEGF, dass VEGF die hemmende Wirkung von Cetuximab auf Krebszellen erhöht. Zusammenfassend habe ich Cetuximab-resistente humane Zelllinien generiert und ihre Eigenschaften durch unterschiedliche Methoden charakterisiert. Mit der Durchführung von NGS habe ich die Methylome und Transkriptome von Cetuximab-resistenten und –sensitiven Zelllinen analysiert, wobei ich eine Deregulierung von mehreren Genen zeigen konnte. Die Analyse von VEGF, als ein potentielles „Kandidaten-Gen“, gab uns einen interessanten Hinweis über die mögliche Verwendung von VEGF, um die Empfindlichkeit von (HN)SCC Zelllinien gegenüber Cetuximab zu erhöhen. Dieses Modell stellt ein wichtiges präklinisches Werkzeug dar, um molekulare Mechanismen der erworbenen Resistenz gegenüber der EGFR-Blockade zu untersuchen und um „Kandidaten-Gene“ zu erkennen, die ebenfalls als Biomarker Verwendung finden können.

The epidermal growth factor receptor (EGFR) is a critical regulator of the self-renewal and differentiation of epidermal cells and is commonly expressed at high levels in a variety of epithelial tumors. Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a distinct cancer type, in which the EGFR has been shown to be overexpressed in up to 100% of cases. This type of cancer is the sixth most common malignant tumor world-wide and responsible for approximately 350,000 deaths annually. Due to the deregulation of EGFR signaling in pre-stage HNSCC, the EGFR is a preferential target for novel therapies, with a broad spectrum of inhibitors being currently under investigation. One such drug, approved by the Food and Drug Administration (FDA), is cetuximab, a monoclonal antibody which inhibits EGFR dimerization and is successfully used in the treatment against cancer. Many patients initially respond well to the treatment, but later on develop a resistance against the drug, which ultimately leads to relapse. Hence, efforts are needed to better understand the mechanisms leading to acquired resistance as well as strategies to overcome it. In this thesis, two squamous cell carcinoma cell lines, one head and neck carcinoma cell line (HNSCC22) and one squamous cell carcinoma cell line (SCC13) were induced to develop resistance to cetuximab. Subsequently, these cell lines were characterized for the molecular changes accompanying loss of cetuximab-sensitivity. No increased late-stage apoptosis was detected in cetuximab-sensitive cells upon exposure to the drug for 48 h. Quantitative proliferation analysis revealed a significant decrease after exposure to cetuximab for 48 h in the cell line SCC13 S. Furthermore, treatment with cetuximab resulted in decreased phosphorylation of the extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2) in a dose-dependent manner in sensitive cell lines, whereas no effect was seen in cetuximab-resistant cell lines. Moreover, all cell lines retained their proliferative potential in vivo, although there were no significant differences in the size of orthotopic tumors derived from sensitive and resistant cell lines. Next generation sequencing (NGS) demonstrated that there were no global differences in DNA methylation between the sensitive and resistant cells. However, changes in the expression of various chromatin remodeling factors as well as of genes involved in the VEGF pathway could be detected. Surprisingly, simultaneous exposure to cetuximab and VEGF revealed that VEGF increased the inhibitory effect of cetuximab on cancer cells. In summary, I have generated cetuximab-resistant human (HN)SCC cell lines and analyzed their properties by various approaches. By performing NGS, I analyzed the methylomes and transcriptomes of cetuximab-resistant and –sensitive cell lines and could find a deregulation of several genes. The analysis of VEGF, as a potent candidate gene, gave us an interesting hint about its potential use to increase cetuximab-sensitivity in HNSCC. This model provides an important preclinical tool to investigate molecular mechanisms of acquired resistance to EGFR blockade and to specify candidate genes involved in acquired resistance, which may be useful as biomarkers.