Title (eng)
Developing a novel method for detecting transient protein-protein interactions in mammalian cells
Parallel title (deu)
Entwicklung einer Methode zur Detektion kurzlebiger Protein-Protein-Interaktionen in Säugetierzellen
Author
Wolfgang Hintringer
Advisor
Egon Ogris
Assessor
Egon Ogris
Abstract (deu)
Kurzlebige Protein-Protein Interaktionen spielen eine zentrale Rolle in den meisten zellulären Signalkaskaden. Es besteht daher ein großes Interesse, die beteiligten Proteine einer solchen Interaktion zu identifizieren um ein besseres Verständnis der Regulierungsmechanismen der Zelle zu ermöglichen. Unglücklicherweise können derartige Interaktionen mit den momentan verfügbaren Methoden nur unzureichend nachgewiesen werden. Hauptziel dieser Arbeit war daher die Entwicklung einer neuen Methode, welche zum Nachweis von kurzlebigen Protein-Protein Interaktionen in Säugetierzellen geeignet ist. Diese Methode, genannt der "preScissionTM assay", verwendet die Proteolyse eines Substratpeptids, fusioniert an ein "Prey"-Protein, durch eine "Human rhinovirus typ 14 3C" protease (preScissionTM protease), welche an ein "Bait"-Protein fusioniert wurde, um die Interaktion zwischen den "Bait"- und "Prey"-Proteinen nachzuweisen. Laut unserem Modell sollten die kinetischen Parameter dieser proteolytischen Reaktion idealerweise eine hohe turnover number (kcat) sowie eine hohe Michaeliskonstante (Km) aufweisen Daher verglichen wir zuerst kinetische Parameter von preScissionTM-Reaktionen in vitro, um ein ideales Substrat für den preScissionTM Assay zu finden. Hierfür wurden zwei Methoden angewandt: Ein auf Förster Resonanzenergietransfer basierender Ansatz sowie ein diskontinuierlicher Enzym-Assay kombiniert mit in-gel western blotting. Das aussichtsreichste Substrat, C3S6, wurde daraufhin benutzt um zu testen, ob Interaktionen zwischen zwei stabil interagierenden Untereinheiten der Protein Phosphatase 2A, genannt PP2A-B55alpha und PP2A-Calpha, nachgewiesen werden können, mit dem Ziel, kurzlebige Interaktionen in weiteren Studien nachzuweisen. Die Ergebnisse zeigten, dass der preScissionTM Assay, unter Verwendung von C3S6 als Substrat, nicht dafür geeignet ist, Protein-Protein-Interaktionen zwischen PP2A- B55alpha und PP2A-Calpha zu erkennen. Weiterführende Experimente zeigten, dass hohe Mengen an endogenen PP2A-Untereinheiten in den Zellen vorhanden waren. Diese könnten durch Binduing an die ektopisch exprimierten PP2A-Untereinheiten die Interaktionen zwischen den "Bait"- und "Prey"-Fusionsproteinen verhindert haben. In Weiterführende Experimente sollten darauf abzielen, die Expression der endogenen PP2A-Untereinheiten zu verringern oder darauf, Enzym-Substratpaare mit optimalen kinetischen Parametern zu identifizieren.
Abstract (eng)
Short-lived protein-protein interactions are of major significance in many essential regulatory processes in cells and therefore are of major interest for research. Unfortunately, currently available methods fall short in their ability to detect and identify transiently interacting proteins. Therefore the primary aim of this thesis was to develop a novel method that is able to detect transient interactions in mammalian cells. This method, named the preScissionTM assay, relies on proteolysis of a substrate peptide fused to a "prey" by a human rhinovirus type 14 3C protease (preScissionTMTM protease) fused to a "bait" in order to confirm the interaction between the two proteins of interest. According to our model, ideal kinetic parameters of this proteolytic reaction consist of a high turnover number (kcat) as well as a high Michaelis constant (Km). As a first aim, I therefore compared kinetic parameters of preScissionTM reactions in vitro to find an ideal substrate for the preScissionTM assay, using two techniques: A Förster resonance energy transfer-based approach and a discontinuous enzyme assay coupled with in-gel western blotting. For the proof of principle, the most promising substrate, C3S6, was subsequently used to test whether the stable interaction between two subunits of mammalian protein phosphatase 2A, named PP2A-B55alpha and PP2A-Calpha, could be detected in mammalian cells, aiming at identifying transient interactions in further studies. The results suggested that the preScissionTM assay is unsuited for detecting mammalian protein- protein interactions such as the ones between PP2A-B55alpha and PP2A-Calpha. The preScissionTM fused to the bait cleaved the substrate fused to the prey to an equal or lesser extent compared to the tested negative controls suggesting that the detection enzyme itself cleaves the substrate independently of an interaction between the PP2A subunits. Subsequent experiments showed that endogenous PP2A subunits were present in the cells in high amounts. These could have interfered with the assay by binding to the ectopically expressed PP2A-B55alpha and Calpha subunits, preventing interactions between the bait and prey fusion proteins. Further experiments should focus on knocking down endogenous PP2A subunit gene expression or on finding an enzyme-substrate pair with optimal kinetic parameters for PPI detection.
Keywords (eng)
PP2Aprotein phosphatase 2Atransient protein-protein interaction
Keywords (deu)
PP2Aprotein phosphatase 2Akurzlebige Protein-Protein-Interaktion
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1301745
rdau:P60550 (deu)
111 S. : Ill., graph. Darst.
Number of pages
119
Association (deu)
Title (eng)
Developing a novel method for detecting transient protein-protein interactions in mammalian cells
Parallel title (deu)
Entwicklung einer Methode zur Detektion kurzlebiger Protein-Protein-Interaktionen in Säugetierzellen
Author
Wolfgang Hintringer
Abstract (deu)
Kurzlebige Protein-Protein Interaktionen spielen eine zentrale Rolle in den meisten zellulären Signalkaskaden. Es besteht daher ein großes Interesse, die beteiligten Proteine einer solchen Interaktion zu identifizieren um ein besseres Verständnis der Regulierungsmechanismen der Zelle zu ermöglichen. Unglücklicherweise können derartige Interaktionen mit den momentan verfügbaren Methoden nur unzureichend nachgewiesen werden. Hauptziel dieser Arbeit war daher die Entwicklung einer neuen Methode, welche zum Nachweis von kurzlebigen Protein-Protein Interaktionen in Säugetierzellen geeignet ist. Diese Methode, genannt der "preScissionTM assay", verwendet die Proteolyse eines Substratpeptids, fusioniert an ein "Prey"-Protein, durch eine "Human rhinovirus typ 14 3C" protease (preScissionTM protease), welche an ein "Bait"-Protein fusioniert wurde, um die Interaktion zwischen den "Bait"- und "Prey"-Proteinen nachzuweisen. Laut unserem Modell sollten die kinetischen Parameter dieser proteolytischen Reaktion idealerweise eine hohe turnover number (kcat) sowie eine hohe Michaeliskonstante (Km) aufweisen Daher verglichen wir zuerst kinetische Parameter von preScissionTM-Reaktionen in vitro, um ein ideales Substrat für den preScissionTM Assay zu finden. Hierfür wurden zwei Methoden angewandt: Ein auf Förster Resonanzenergietransfer basierender Ansatz sowie ein diskontinuierlicher Enzym-Assay kombiniert mit in-gel western blotting. Das aussichtsreichste Substrat, C3S6, wurde daraufhin benutzt um zu testen, ob Interaktionen zwischen zwei stabil interagierenden Untereinheiten der Protein Phosphatase 2A, genannt PP2A-B55alpha und PP2A-Calpha, nachgewiesen werden können, mit dem Ziel, kurzlebige Interaktionen in weiteren Studien nachzuweisen. Die Ergebnisse zeigten, dass der preScissionTM Assay, unter Verwendung von C3S6 als Substrat, nicht dafür geeignet ist, Protein-Protein-Interaktionen zwischen PP2A- B55alpha und PP2A-Calpha zu erkennen. Weiterführende Experimente zeigten, dass hohe Mengen an endogenen PP2A-Untereinheiten in den Zellen vorhanden waren. Diese könnten durch Binduing an die ektopisch exprimierten PP2A-Untereinheiten die Interaktionen zwischen den "Bait"- und "Prey"-Fusionsproteinen verhindert haben. In Weiterführende Experimente sollten darauf abzielen, die Expression der endogenen PP2A-Untereinheiten zu verringern oder darauf, Enzym-Substratpaare mit optimalen kinetischen Parametern zu identifizieren.
Abstract (eng)
Short-lived protein-protein interactions are of major significance in many essential regulatory processes in cells and therefore are of major interest for research. Unfortunately, currently available methods fall short in their ability to detect and identify transiently interacting proteins. Therefore the primary aim of this thesis was to develop a novel method that is able to detect transient interactions in mammalian cells. This method, named the preScissionTM assay, relies on proteolysis of a substrate peptide fused to a "prey" by a human rhinovirus type 14 3C protease (preScissionTMTM protease) fused to a "bait" in order to confirm the interaction between the two proteins of interest. According to our model, ideal kinetic parameters of this proteolytic reaction consist of a high turnover number (kcat) as well as a high Michaelis constant (Km). As a first aim, I therefore compared kinetic parameters of preScissionTM reactions in vitro to find an ideal substrate for the preScissionTM assay, using two techniques: A Förster resonance energy transfer-based approach and a discontinuous enzyme assay coupled with in-gel western blotting. For the proof of principle, the most promising substrate, C3S6, was subsequently used to test whether the stable interaction between two subunits of mammalian protein phosphatase 2A, named PP2A-B55alpha and PP2A-Calpha, could be detected in mammalian cells, aiming at identifying transient interactions in further studies. The results suggested that the preScissionTM assay is unsuited for detecting mammalian protein- protein interactions such as the ones between PP2A-B55alpha and PP2A-Calpha. The preScissionTM fused to the bait cleaved the substrate fused to the prey to an equal or lesser extent compared to the tested negative controls suggesting that the detection enzyme itself cleaves the substrate independently of an interaction between the PP2A subunits. Subsequent experiments showed that endogenous PP2A subunits were present in the cells in high amounts. These could have interfered with the assay by binding to the ectopically expressed PP2A-B55alpha and Calpha subunits, preventing interactions between the bait and prey fusion proteins. Further experiments should focus on knocking down endogenous PP2A subunit gene expression or on finding an enzyme-substrate pair with optimal kinetic parameters for PPI detection.
Keywords (eng)
PP2Aprotein phosphatase 2Atransient protein-protein interaction
Keywords (deu)
PP2Aprotein phosphatase 2Akurzlebige Protein-Protein-Interaktion
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1301746
Number of pages
119
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