Title (eng)
Functional characterization of mammalian Polycomb Response Elements
Parallel title (deu)
Funktionelle Charakterisierung von Saeugetier "Polycomb Response ELements"
Author
Tanja Drexel
Advisor
Leonie Ringrose
Assessor
Leonie Ringrose
Abstract (deu)
Mehrzellige Organismen sind während ihrer Entwicklung bestrebt nicht nur an Größe zuzunehmen, sondern auch spezialisierte Strukturen in Form unterschiedlicher Zellen und Gewebe auszubilden. Dies wird vor allem durch Änderungen im transkriptionellen Profil der Zellen bewerkstelligt welches über viele Zellgenerationen.erhalten bleiben muss. Die hoch konservierten “Polycomb und Trithorax group” (PcG und TrxG) Proteine stellen ein gen-regulatorisches System zur Verfügung, welches nicht nur für die Erhaltung des Status differenzierter Zellen, sondern auch von Stammzellen verantwortlich ist [1, 2]. PcG und TrxG Proteine wirken über Polycomb Response Elements (PREs), welche daher eine entscheidende Rolle in der epigenetischen Vererbung spielen [2-4]. PREs sind am besten in Fliegen beschrieben und können im Genom von Drosophila Melanogaster sogar mittels eines für diesen Modellorganismus spezifisch designten Algorithmus bestimmt werden [5]. Denoch, obwohl TrxG und PcG hoch konserviert sind, sind PREs nicht konserviert und aus diesem Grund fehlt bis heute ein Algorithmus für die Bestimmung von PREs im Säugetiergenom. Aus diesem Grund hat eine Bioinformatikerin in der Ringrose Forschungsgruppe den Fliegen-Algorithmus an das Säugetiergenom angepasst und konnte dadurch mehrere PREs bestimmen. Da bioinformatisch getroffene Vorhersagen experimentel bestätigt werden müssen, war es meine Aufgabe die Funktion der PREs zu charakterisieren. Dafür habe ich mich eines, schon teilweise etablierten Luciferase Reporter Systems bedient und habe eine Auswahl verschiedener mutmasslicher PREs in das Reporter Konstrukt kloniert. Diese PRE-Reporter Konstrukte wurden mittels homologer Rekombination stabil in den Rosa-26 locus in embryonale Stammzellen der Maus integriert. Die Wirkung der PREs auf den Luciferase Reporter wurde im transienten Experiment und in den stabilen Zelllinien bestimmt. Dabei zeigte sich dass Ptch1 den Reporter in beiden experimentllen Ansätzen reprimieren konnte. Des weiteren versuchte ich die Frage, ob dieser reprimierende Effekt PcG abhängig ist, zu adressieren indem ich mittels siRNAs geziehlt den Abbau von wichtigen Mitgliedern des “Polycomb Repressive Complexe 2” (PRC2) Komplexes hervorgerufen habe. Des weiteren habe ich dazu beigetragen mögliche Limitationen dieses Systems auf zuzeigen, was für zukünftige Experimente eine wichtige Rolle spielen wird.
Abstract (eng)
During development it is the main aim of multicellular organisms to grow not only in size but also to specialize and form different cells and tissues. This is accomplished by changes in the transcriptional profile of the cells, which has to be maintained during several cell divisions. The highly conserved Polycomb (PcG) and Trithorax (TrxG) group proteins constitute a gene regulatory system that is essential for maintaining the correct identity of both stem cells and differentiated cells [1, 2]. The PcG and TrxG proteins act through cis-regulatory elements called Polycomb/Trithorax response elements (PREs) which are crucial for epigenetic inheritance [2-4]. PREs are best characterized in flies, and can be predicted even genome wide via an algorithm specifically designed for Drosophila melanogaster [5]. However, although PcG and TrxG proteins are highly conserved, PREs are not, and therefore a computational approach to predict PREs in mammals has previously been lacking. A bioinformatician in the Ringrose group was able to adapt the fly algorithm to the mammalian system and could predict several putative PREs in the mouse genome. Since these predictions had to be confirmed it was my task to revalidate them experimentally. I integrated several PRE reporter constructs stably into ROSA-26 in mouse ESCs, to avoid genomic position effects and measured the luciferase expression. For this purpose I took advantage of an already established luciferase reporter assay system and tested the repressive effect of the PREs on the reporter in transient experiments and stable cell lines. In order to address the question whether the silencing of the reporter is PcG dependent, I furthermore depleted PcG proteins via siRNA knockdowns. In this thesis I could show that several PREs showed silencing of the reporter in transient experiments whereas they behaved differently in Rosa-26 in stable ES cell lines. The PRE Ptch1 was able to silence the reporter even in the stable cell lines. Furthermore I contributed in the improvement of the gene targeting workflow and could show possible limitations of the luciferase reporter assay system, which will be important for future experiments.
Keywords (eng)
PREembryonic stem cellsPolycomb
Keywords (deu)
PREembryonale StammzellenPolycomb
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1301948
rdau:P60550 (deu)
102 S. : Ill., graph.Darst.
Number of pages
102
Association (deu)
Title (eng)
Functional characterization of mammalian Polycomb Response Elements
Parallel title (deu)
Funktionelle Charakterisierung von Saeugetier "Polycomb Response ELements"
Author
Tanja Drexel
Abstract (deu)
Mehrzellige Organismen sind während ihrer Entwicklung bestrebt nicht nur an Größe zuzunehmen, sondern auch spezialisierte Strukturen in Form unterschiedlicher Zellen und Gewebe auszubilden. Dies wird vor allem durch Änderungen im transkriptionellen Profil der Zellen bewerkstelligt welches über viele Zellgenerationen.erhalten bleiben muss. Die hoch konservierten “Polycomb und Trithorax group” (PcG und TrxG) Proteine stellen ein gen-regulatorisches System zur Verfügung, welches nicht nur für die Erhaltung des Status differenzierter Zellen, sondern auch von Stammzellen verantwortlich ist [1, 2]. PcG und TrxG Proteine wirken über Polycomb Response Elements (PREs), welche daher eine entscheidende Rolle in der epigenetischen Vererbung spielen [2-4]. PREs sind am besten in Fliegen beschrieben und können im Genom von Drosophila Melanogaster sogar mittels eines für diesen Modellorganismus spezifisch designten Algorithmus bestimmt werden [5]. Denoch, obwohl TrxG und PcG hoch konserviert sind, sind PREs nicht konserviert und aus diesem Grund fehlt bis heute ein Algorithmus für die Bestimmung von PREs im Säugetiergenom. Aus diesem Grund hat eine Bioinformatikerin in der Ringrose Forschungsgruppe den Fliegen-Algorithmus an das Säugetiergenom angepasst und konnte dadurch mehrere PREs bestimmen. Da bioinformatisch getroffene Vorhersagen experimentel bestätigt werden müssen, war es meine Aufgabe die Funktion der PREs zu charakterisieren. Dafür habe ich mich eines, schon teilweise etablierten Luciferase Reporter Systems bedient und habe eine Auswahl verschiedener mutmasslicher PREs in das Reporter Konstrukt kloniert. Diese PRE-Reporter Konstrukte wurden mittels homologer Rekombination stabil in den Rosa-26 locus in embryonale Stammzellen der Maus integriert. Die Wirkung der PREs auf den Luciferase Reporter wurde im transienten Experiment und in den stabilen Zelllinien bestimmt. Dabei zeigte sich dass Ptch1 den Reporter in beiden experimentllen Ansätzen reprimieren konnte. Des weiteren versuchte ich die Frage, ob dieser reprimierende Effekt PcG abhängig ist, zu adressieren indem ich mittels siRNAs geziehlt den Abbau von wichtigen Mitgliedern des “Polycomb Repressive Complexe 2” (PRC2) Komplexes hervorgerufen habe. Des weiteren habe ich dazu beigetragen mögliche Limitationen dieses Systems auf zuzeigen, was für zukünftige Experimente eine wichtige Rolle spielen wird.
Abstract (eng)
During development it is the main aim of multicellular organisms to grow not only in size but also to specialize and form different cells and tissues. This is accomplished by changes in the transcriptional profile of the cells, which has to be maintained during several cell divisions. The highly conserved Polycomb (PcG) and Trithorax (TrxG) group proteins constitute a gene regulatory system that is essential for maintaining the correct identity of both stem cells and differentiated cells [1, 2]. The PcG and TrxG proteins act through cis-regulatory elements called Polycomb/Trithorax response elements (PREs) which are crucial for epigenetic inheritance [2-4]. PREs are best characterized in flies, and can be predicted even genome wide via an algorithm specifically designed for Drosophila melanogaster [5]. However, although PcG and TrxG proteins are highly conserved, PREs are not, and therefore a computational approach to predict PREs in mammals has previously been lacking. A bioinformatician in the Ringrose group was able to adapt the fly algorithm to the mammalian system and could predict several putative PREs in the mouse genome. Since these predictions had to be confirmed it was my task to revalidate them experimentally. I integrated several PRE reporter constructs stably into ROSA-26 in mouse ESCs, to avoid genomic position effects and measured the luciferase expression. For this purpose I took advantage of an already established luciferase reporter assay system and tested the repressive effect of the PREs on the reporter in transient experiments and stable cell lines. In order to address the question whether the silencing of the reporter is PcG dependent, I furthermore depleted PcG proteins via siRNA knockdowns. In this thesis I could show that several PREs showed silencing of the reporter in transient experiments whereas they behaved differently in Rosa-26 in stable ES cell lines. The PRE Ptch1 was able to silence the reporter even in the stable cell lines. Furthermore I contributed in the improvement of the gene targeting workflow and could show possible limitations of the luciferase reporter assay system, which will be important for future experiments.
Keywords (eng)
PREembryonic stem cellsPolycomb
Keywords (deu)
PREembryonale StammzellenPolycomb
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1301949
Number of pages
102
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