Lange Zeit wurde vermutet das Nitritoxidierer nur in vier verschiedenen bakteriellen Phyla zu finden sind. Aber nach der Entdeckung des an Kälte adaptierten Nitritoxidierers‚ ‚Candidatus Nitrotoga arctica‘ (Betaproteobacteria), im Permafrostboden Sibiriens und Nitrolancetus hollandicus (Chloroflexi) in einem Laborreaktor wurde erkannt, dass Nitritoxidierer diverser sind als bisher angenommen. Allerdings ist das Wissen über diese Mikroorganismen sehr limitiert, daher war das Ziel dieser Studie diese Wissenslücke zu verkleinern. Interessanterweise wurden bei einer Untersuchung verschiedenster Umweltproben, Nitrotoga-ähnliche Bakterien auch in zahlreichen Kläranlagen, See beziehungsweise Fluss Sedimenten entdeckt, was eine weite Verbreitung dieser Organismen in der Umwelt bedeuten kann. Diese Tatsache wirft auch die Frage über die Abundanz und die Funktion von Nitrotoga in der Umwelt im Allgemeinen und in Kläranlagen im Speziellen auf. Besonders in Kläranlagen ist es wichtig die ablaufenden Prozesse und die Interaktionen der in der Reinigung des Abwassers involvierten Organismen zu verstehen um ein zusammenbrechen des Systems zu verhindern. Es wurden die Abundanz und die Interaktion von Nitrotoga mit Ammoniak oxidierenden Organismen im Schlamm aus den Kläranlagen Bad Zwischenahn, Deuz und Langenzenn untersucht. Des Weiteren wurde die Funktion dieser Organismen im Schlamm der Kläranlagen Deuz und Bad Zwischenahn nachgewiesen. In zwei dieser Kläranlagen (Langenzenn und Bad Zwischenahn) stellt Nitrotoga den einzigen Nitrit oxidierenden Mikroorganismus dar. FISH und digitale Bildanalysen deuteten auf eine Kolokalisation zwischen Nitrotoga-ähnlichen Bakterien und Ammoniak oxidierende Mikroorganismen in den Belebtschlämmen der Kläranlagen Bad Zwischenahn und Deuz hin. Im Belebtschlamm der Kläranlage Langenzenn konnte sogar eine Verdrängung von Nitrotoga festgestellt werden, was zur Annahme führte, dass sich in diesem Schlamm noch unbekannte Nitrit oxidierende Bakterien oder sogar unbekannte Ammoniak oxidierende Organismen befinden. Des Weiteren könnten Nitrotoga-ähnliche Bakterien einen anderen Lebensstil aufweisen der sie von Ammoniak oxidierenden Organismen unabhängig macht. Die Abundanzen von Nitrotoga-ähnlichen Bakterien waren in den Belebtschlämmen der Kläranlagen Deuz und Langenzenn sehr gering (<1%). Allerdings koexistiert im Belebtschlamm der Kläranlage Deuz Nitrotoga mit zwei Gruppen von Nitrospira, wobei die Kolokalisationsanalysen unterschiedliche Verteilungsmuster für beide Organismen ergaben, was auf eine Nischendifferenzierung hindeutet. Im Belebtschlamm von Bad Zwischenahn ergab die Quantifizierung von Nitrotoga-ähnlichen Organismen eine Abundanz von 1.4% die allerdings hoch genug sein kann, um für eine ausreichende Entfernung des Nitrits zu sorgen. MAR-FISH Analysen wurden in den Belebtschlämmen aus Bad Zwischenahn und Deuz bei verschiedenen Temperaturen und Nitrit Konzentrationen durchgeführt. Ziel war es, eine Nitrit oxidierende Aktivität dieser Organismen in den Schlammproben beider Kläranlagen zu bestätigen, da die Fähigkeit des Wachstums mit Nitrit und Kohlenstoff als ausschließlicher Energie- und Kohlenstoffquelle bisher nur indirekt an Anreicherungskulturen beobachtet wurde. Interessanterweise wurde eine Einlagerung von [14C]Bikarbonat nicht nur bei den erwarteten Temperaturen (4°C, 10°C, 14°C und 20°C) und Nitrit Konzentrationen (0,1 mM, 0,5 mM und 1 mM), sondern auch bei höheren Temperaturen (27°C) und Nitrit Konzentrationen (5 mM und 10 mM) beobachtet. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass Nitrotoga-ähnliche Bakterien dazu fähig sind, kurze Zeit auch bei höheren Temperaturen und Nitrit Konzentrationen aktiv zu sein. Interessanterweise, ergaben auf 16S rRNS basierte phylogenetische Analysen Hinweise auf eine Diversität innerhalb des Genus. Zusätzlich zeigten die 16S rRNS Gen Sequenzen eine hohe Ähnlichkeit (98-99%) zueinander, was darauf hindeutet, dass es sich bei Nitrotoga noch um ein junges Genus handelt. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass Nitrotoga-ähnliche Bakterien eine ökologische Nische in natürlichen und künstlichen Habitaten gefunden haben und sogar wichtige Nitritoxidierer in jenen Kläranlagen sein könnten, die für diesen Organismus optimale Temperaturen und Nitritkonzentrationen bieten.

Nitrolancetus hollandicus ist ein thermotoleranter Nitritoxidierer, der eine Toleranz gegenüber hohen Nitrit (bis zu 75 mM) und Ammonium Konzentrationen (über 200 mM) aufweist. Dieser Organismus wurde in einem Laborreaktor entdeckt, der bei hohen Temperaturen (35°C) betrieben wurde und hohe Konzentration an Ammonium (428 mM) aufwies. Ein wenig später wurden nahe Verwandte dieses Organismus in einem SHARON Reaktor in Korea entdeckt. Interessanterweise offenbarten phylogenetische Analysen eine Zugehörigkeit dieses Organismus zur Klasse Thermomicrobia innerhalb des Phylums Chloroflexi, in welchen Nitrolancetus den ersten Nitritoxidierer darstellt. Zur Identifizierung des natürlichen Habitats dieses Organismus wurden verschiedene Proben untersucht die optimale Bedingungen (5-20 mM Nitrit und 4-200 mM Ammonium) für Nitrolancetus darstellen könnten. Mittels Verwendung unterschiedlicher Methoden wurden allerdings nur einzelne FISH Signale im Belebtschlamm einer Kläranlage entdeckt. Zusätzlich wurde mittels BLAST (NCBI) eine kurze 16S rRNS Gen Sequenz, die eine hohe Ähnlichkeit zur Nitrolancetus 16S rRNS Gen Sequenz besitzt, in der NCBI Datenbank gefunden. Obwohl in zahlreichen Umweltproben nach Nitrolancetus-ähnlichen Bakterien gesucht wurde, wurden keine weiteren Hinweise auf das Habitat dieses Organismus gefunden, was auf ein seltenes Vorkommen von Nitrolancetus in der Umwelt hindeutet. Die Sequenzierung der genomischen DNS von Nitrolancetus hollandicus mittels Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien ergaben die Präsenz von vier hoch ähnlichen (90,3-95,8%) nxrA Genen. Da alle vier nxrA Gene noch nicht vollständig sequenziert waren, wurden spezifische Primer entwickelt, die an diese Gene binden sollten. Klonierung und Sequenzierung der nxrA Gene von Nitrolancetus hollandicus offenbarten eine phylogenetische Verwandtschaft zu NXR von Nitrobacter spp. und Nitrococcus mobilis innerhalb der DMSO Reduktase Typ II Enzym Familie. Des Weiteren gab es Hinweise, dass einer dieser Kopien innerhalb des nxr Operons lokalisiert ist, was mittels einer spezifischen PCR überprüft und bewiesen wurde.

For a long time nitrite oxidizing bacteria (NOB) were thought to be restricted to four different bacterial phyla. However, after isolation of a cold-adapted NOB, ‘Candidatus Nitrotoga arctica’ (Betaproteobacteria), in the Siberian permafrost and Nitrolancetus hollandicus (Chloroflexi) in a laboratory-scale bioreactor, it was realized that NOB are more diverse than expected. Since the knowledge about these organisms is limited, this study was focused on the investigation of these newly detected NOB. Interestingly, Nitrotoga-like bacteria were isolated from numerous activated sludge samples as well as lake and river sediments located in temperate climatic regions, which suggests wide-spread presence of Nitrotoga in the environment. The presence of this organism in wastewater treatment plants (WWTPs) raised the question about their abundance, function and co-localization pattern in such systems, since WWTPs are of fundamental importance for removal of sewage produced by humans. Furthermore, the knowledge about the interaction between communities, involved in removal of pollutants, is important to avoid a breakdown of these systems. Therefore, the abundance and spatial distribution pattern of Nitrotoga-like bacteria was analyzed in activated sludge samples from three WWTPs (Deuz, Langenzenn and, Bad Zwischenahn). Quantification revealed only low abundance (<1%) in activated sludge from WWTPs Deuz and Langenzenn but higher abundance (1.4%) in activated sludge from WWTP Bad Zwischenahn. In WWTP Deuz Nitrotoga co-occurs with a second nitrite oxidizing population (Nitrospira). FISH and digital image analysis of both groups unveiled a co-localization with ammonium oxidizing populations. Interestingly, these analyses revealed additionally a different distribution pattern for both NOB, suggesting a niche differentiation of these populations. In activated sludge from Bad Zwischenahn and Langenzenn, Nitrotoga is the only known nitrite oxidizing organism. The spatial distribution pattern of Nitrotoga in activated sludge from Bad Zwischenahn revealed a co-localization between Nitrotoga-like bacteria and ammonia oxidizing bacteria (AOB). Interestingly, the same analysis revealed displacement of Nitrotoga-like bacteria in activated sludge from WWTP Langenzenn, which might indicate the presents of an unknown NOB or AOB. Furthermore, Nitrotoga-like bacteria might exhibit a different lifestyle, which makes a co-localization with AOB not necessary. Since a nitrite oxidizing activity of Nitrotoga was so far only investigated by measuring the stoichiometrically oxidation of nitrite to nitrate during incubation of enrichments, MAR-FISH analyses were performed to link the nitrite oxidizing activity to the phylogenetic identity of the nitrite oxidizing organisms. Interestingly, the nitrite oxidizing activity was not only shown at expected but also at high temperature (27°C) and nitrite concentrations (5 mM, 10 mM). However, Nitrotoga-like bacteria were only detected in such WWTPs, which are operated at low temperature (10-17°C) and NO2- concentrations (0.3 mM). Therefore, it might be suggested that Nitrotoga is able to survive higher temperature and nitrite concentration only for short incubation times but is outcompeted by other NOB during long incubation periods. Interestingly, 16S rRNA based in-depth phylogenetic analysis revealed the presence of a diversity within the genus Nitrotoga. Additionally, 16S rRNA gene sequences showed a very high similarity (98-99%) to each other, suggesting that Nitrotoga represents a very young genus. The results of this study suggests, that Nitrotoga-like bacteria found an ecological niche in natural and engineered habitats and might even be an important nitrite oxidizer in such WWTPs that provide optimal temperature and nitrite concentrations.

Nitrolancetus hollandicus is a thermotolerant (optimum at 40°C) NOB, which shows tolerance to high nitrite and ammonia concentrations. This organism has been detected in a laboratory-scale bioreactor, which was operated at 35°C with a high ammonia load of up to 428 mM. Additionally, a close relative of this organism has been detected in a SHARON reactor in Korea. Furthermore, phylogenetic analysis revealed the affiliation of Nitrolancetus to the class Thermomicrobia within the phylum Chloroflexi, in which this organism represents the first NOB. Interestingly, Nitrolancetus hollandicus was not detected in activated sludge originated from a full-scale nitritation bioreactor (SHARON process) operating in WWTP Rotterdam Dokhaven, which was used as inoculum for the laboratory-scale bioreactor. Therefore, for identification of natural habitats, various samples from engineered and natural habitats, which might provide optimal conditions, were screened by using different methods. However, only rare positive FISH signals in one wastewater treatment plant and a short 16S rRNA gene sequence submitted to NCBI Database by a Japanese team could be detected, suggesting a rare occurrence of this organism in the environment. Sequencing of the genomic DNA of Nitrolancetus hollandicus with high throughput techniques revealed the presence of four highly identically (90.3%-95.8%) nxrA genes. Since all nxrA gene sequences were incomplete one set of primer (Nlho_nxrA0038F/Nlho_nxrA3595R) was designed that targets all nxrA copies. Cloning and sequencing of these nxrA genes indicated a phylogenetic relationship to NXR of Nitrobacter spp. and Nitrococcus mobilis within the family of DMSO reductase type II enzymes. Interestingly, the NXR of these organisms is related to an NXR-like enzyme, detected in the anaerobic, nitrite dependent methane oxidizer ‘Candidatus Methylomirabilis oxyfera’, suggesting that horizontal gene transfer established the NXR in ancestors of these bacteria. Furthermore, one nxrA gene copy was suggested to be located within the nxr operon which was confirmed via PCR.