Unkonjugiertes Bilirubin (UCB), das Abbauprodukt des Hämoglobinstoffwechsels, ist ein wirkungsvolles Antioxidans. Moderat erhöhte Blutbilirubinkonzentrationen (wie bei Gilberts Syndrom (GS)), sind assoziiert mit einem verminderten Risiko für chronische, nicht übertragbare Erkrankungen (NCDs) wie kardiovaskuläre Komplikationen und Krebs. Die vorliegende Studie untersuchte, ob zirkulierendes Bilirubin mit Veränderungen von DNA Schäden, sowie mit einem veränderten Lipidstoffwechsel und Entzündungsstatus in Verbindung gebracht werden kann und ob daraus ein Erklährungsansatz für das verminderte Krankheitsbild abgeleitet werden kann. Dazu wurden eine Humanstudie und ein Tiermodell geplant und durchgeführt. In einer Fall-Kontrollstudie im Querschnittdesign wurden eine Vielzahl an aussagekräftigen Biomarkern in Proben von Studienteilnehmern mit GS gemessen und mit den Ergebnissen entsprechender Kontrollpersonen verglichen (n= 38 pro Gruppe, gesamt n= 76; Alter und Geschlecht angepasst). Veränderungen der DNA Schädigung/Oxidation wurden mit dem Mikronukleus Test in peripheren Blutlymphozyten (PBLs) und Mundschleimhautzellen bestimmt. Weiters wurde die Einzelzellgel Eletrophorese (SCGE) angewandt und weitere Biomarker im Urin (8-oxo-2-Deoxyguanosin (8oxodGuo, DNA Oxidation) und 8-oxo-Guanosin (8oxoGuo, RNA Oxidation) wurden hinzugezogen. Das Lipidprofil (Lipoproteine, Triglyzeride, Cholesterine, inklusive Subfraktionen des LDL-Cholesterins) und der Entzündungsstatus (Interleukin 6 und 1β (IL), Tumor Nekrose Faktor α (TNF-α), Serum amyloid A (SAA), C-reaktives Protein (CRP)) wurden analysiert sowie weitere Metaboliten, die zum Häm Stoffwechsel zählen (UCB, Carboxy Hämoglobin (CO-Hb) und Eisen).
Um die Daten der Humanstudie zu unterstützen wurde ein Tiermodell mit Gunn Ratten (erhöhtes Blutbilirubin) verwendet und mit Wistar Ratten (Blutbilirubin im Normalbereich, n= 20 pro Gruppe, gesamt n= 40) verglichen. Dazu wurde der SCGE Test durchgeführt und das Lipidprofil im Rattenserum bestimmt.
Die GS Gruppe und die Gunn Ratten hatten, verglichen mit den Kontrollgruppen, signifikant höhere UCB Konzentrationen und einen geringeren Körpermasseindex (BMI) bzw. eine geringere Körpermasse bei den Ratten, allerdings nur bei den weiblichen (p<0.05). Darüber hinaus wurden keine weiteren signifikanten Unterschiede bezüglich der DNA Schädigung von Studienteilnehmern mit GS verglichen mit der Kontrollgruppe festgestellt. Überraschenderweise hatten die Gunn Ratten im Vergleich zu den Kontrollratten signifikant höhere Strangbrüche in einkernigen Blutzellen des peripheren Blutes (PBMCs, p<0.05).
Nach Analyse des Lipidprofils stellte sich heraus, dass Individuen mit GS reduzierte Konzentrationen an Gesamtcholesterin, Triglyzeriden, LDL Subfraktionen (LDL-1 und LDL-2), Lipoproteinen (Apo-B) und ein vermindertes Verhältnis aus Apo-B zu Apo-A1 aufwiesen (p<0.05). Außerdem wurden reduzierte IL-6 und SAA Konzentrationen sowie erhöhte IL-1β Level im Vergleich zu der Kontrollgruppe gefunden (p<0.05; p=0.09; p<0.01). Diese Daten wurden durch die Lipidanalyse der Nager unterstützt, da die Gunn Ratten ebenfalls reduzierte Gesamtcholesterin- und Triglyzerid Werte aufwiesen verglichen mit den Wistar Ratten (p<0.001). Weiters wurde festgestellt, dass Personen mit GS höhere CO-Hb- und Eisenkonzentrationen aufwiesen (p<0.01; p<0.001). Auch Lebensstileffekte (Alter und BMI) wurden untersucht und es stellte sich heraus, dass die GS Gruppe mit einem Alter von ≥30 Jahren, verglichen mit der jüngeren GS Gruppe, niedrigere chromosomale Schädigungen in den Epithelzellen aufwiesen (p<0.05). Bei der gleichen Gruppe (GS ≥30 Jahren) wurden auch verringerte Level an Gesamt- und LDL-Cholesterin, Triglyzeriden, LDL-Subfraktionen, Apolipoprotein B1 und ein vermindertes Verhältnis aus Apo-B zu Apo-A1 festgestellt verglichen mit der älteren Kontrollgruppe (p<0.05). Niedrigere 8oxodGuo Konzentrationen (p<0.05) wurden in der Gruppe mit einem BMI ≥25 kg/m2 gemessen, obwohl diese Studienteilnehmer niedrigere Bilirubinwerte hatten als normalgewichtige Teilnehmer (p<0.05).

Diese Resultate deuten eine DNA schützende Wirkung in epithelialem Gewebe von älteren Individuen mit GS an. Allerdings ist ein krankheitspräventiver Effekt, wie er in epidemiologischen Studien gezeigt wurde, wohl nicht auf eine DNA schützende Wirkung von Bilirubin (gemessen in PBMCs) zurückzuführen. Das veränderte Lipidprofil und der reduzierte Entzündungsstatus von Personen mit erhöhten Bilirubinspiegeln, besonders von älteren Individuen, tragen möglicherweise, zusätzlich zu den bereits bekannten antioxidativen Effekten von Bilirubin zum Gesundheitsschutz bei. Die Beziehung zwischen UCB, Häm, Eisen und CO-Hb weist auf eine positive Rückkopplungs Schleife (feedback loop) der Hämoxygenase hin, die eventuell über Bilirubin vermittelt wird. Abschließend, ist zu vermuten, dass der reduzierte BMI in der GS Gruppe möglicherweise indirekt zu einem reduzierten Risiko an NCDs beiträgt.
Die vielversprechenden Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, die hauptsächlich auf Beobachtungen beruhen, erfordern weiterführende Studien auch auf mechanistischer Ebene.

Unconjugated Bilirubin (UCB), the product of heme catabolism, is known as a potent antioxidant. A mild elevation of circulating plasma UCB, also known as Gilberts syndrome (GS) is associated with a reduced risk of non communicable diseases (NCDs) such as cardiovascular diseases and cancer. This study aimed to find explanations for the reduced disease risk observed in GS by exploring whether serum bilirubin concentrations are linked to changes in DNA damage, to altered lipid metabolism and inflammation status in human and animal models. Therefore, a variety of biomarkers were investigated in a cross sectional case control study comparing healthy subjects with Gilberts syndrome to age- and gender matched controls (n= 38 per group, total n= 76). Changes in DNA oxidation were evaluated using the cytokinesis-block micronucleus assay (CBMN), buccal micronucleus cytome assay (BMcyt) and the single cell gel electrophoresis (SCGE) assay. In addition, urinary 8-oxo-2-deoxyguanosine (8oxodGuo) for estimation of DNA oxidation and urinary 8-oxo-guanosine (8oxoGuo) that reflects RNA oxidation were measured. Moreover, the lipid profile (lipoproteins, triglycerides (TG), cholesterols, including subfractions of LDL) and biomarkers of inflammation (interleukin 6 (IL-6), IL-1β, tumor necrosis factor α (TNF-α), serum amyloid A (SAA), C-reactive protein (CRP)) as well as heme metabolites (UCB, carboxy hemoglobin (CO-Hb) and iron) were analysed. In addition, a hyperbilirubinemic rodent model (Gunn rats vs. Wistar rats, n= 20 per group, total n= 40) was selected to support the data observed in the human study. Within this trial, changes in DNA damage were determined in different tissues by using the SCGE assay, together with assessing the lipid profile. The GS group and the Gunn rats had significantly higher UCB concentrations and a lower body mass index (BMI; human data) or lower body mass (female Gunn rats only) compared to their respective controls (p<0.05). With reference to DNA damage no significant difference in GS subjects versus controls was observed. Surprisingly, significantly higher DNA strand breaks (measured in white blood cells, PBMCs) were identified in Gunn rats when compared to controls. Relative to their controls GS subjects had a significantly improved lipid profile (reduced total cholesterol, LDL-cholesterol, TG, LDL subfractions (LDL-1+LDL-2), lipoprotein (Apo-B), Apo-B/Apo-A1 ratio (p<0.05). Moreover, lower IL-6 and SAA concentrations and higher IL-1β concentrations were found when compared to controls (p<0.05; p=0.09; p<0.01). These data were confirmed by lipid analyses in the rodent model, showing that Gunn rat serum contained lower total cholesterol and TG concentrations as compared to that of normobilirubinemic rats (p<0.001). Furthermore, individuals with GS had significantly higher levels of CO-Hb and iron (p<0.01; p<0.001). When lifestyle effects (age and BMI) were considered statistically, lower formation of buccal anomalies were found in the GS subgroup of ≥30 years compared to the GS subgroup of <30 years of age (p<0.05). GS subjects of ≥30 years of age had reduced lipid variables (total cholesterol and LDL-C, TG and LDL-C subfractions, Apo-B/Apo-A1 ratio, Apo-B) when compared to older controls (p<0.05). The group with a BMI ≥25 kg/m2 had lower 8oxodG concentrations and tended to have higher DNA strand breaks. Simultaneously, these subjects had lower UCB levels than normal weight subjects (p<0.05; p=0.064; p<0.05). These findings suggest DNA protection in older GS individuals epithelia, however, a disease preventing effect which has been reported previously in a series of epidemiological studies, does not seem to be based on an immediate UCB-derived DNA protection. Consequently, the effects observed in PBMCs utilising the SCGE assay were not as pronounced. The link to a better health status (e.g. reduced risk of NCDs) observed in GS individuals, is probably rather predicted on the lower BMI, altered lipid profile and reduced inflammation status that were noticed in hyperbilirubinemic subjects, particularly in the older individuals. Therefore, it is likely that UCB, in addition to its commonly known antioxidant behavior, also exceeds its beneficial health effects via alternate mechanisms which are yet to be explored.
In this respect a newly hypothesised relationship between UCB, heme, iron and CO-Hb possibly indicates a positive feedback loop that includes UCB as a direct inducer of HO-1.
The results of the present study that are mainly based on observations, should be pursued in future, to follow-up on this and other hypotheses.