Während der neuronalen Entwicklung reagieren Axone auf eine Bandbreite an Signalen um zu ihren Zielen zu gelangen. Wachstumskegel an der Spitze der Axone wählen ihren Pfad mit Hilfe von extrazellulären Signalen den Steuerungssignalen. Diese bestehen aus fingerähnlichen Ausbuchtungen, Filopodien und schleierartigen Strukturen, die als Lamellopodien bezeichnet werden. Signale können Wachstumskegel entweder anziehen oder abstoßen. Extrazelluläre Signale sind Moleküle die von Zellen entlang des axonalen Weges segregiert werden oder auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Sie beinhalten Netrin, Semaphorine und Ephrine. Diese Steuerungssignale regulieren das Vorandringen der Wachstumskegel sowie Richtung und Verzweigung während Neuausrichtungen des Zytoskeletts.
Die Dynamik von Wachstumskegeln wird durch zwei Komponenten des Zytoskeletts reguliert, Aktin und Mikrotubuli. Mikrotubuli sind extrem dynamische Strukturen, involviert in Neuritenextension, -repulsion und -polarität. Die Dynamik von Mikrotubuli wird reguliert durch MAP1Bs (microtubule associated protein 1B), eine Klasse von Proteinen die entlang der Mikrotubuli binden und deren Funktion in Wachstum und Steuerung regulieren. MAP1B knockout (KO) Mäuse zeigen verschiedene Defekte, unter anderem Agenesie des Corpus Callosum und fehlgeleitete Kommissuren welche Probst-Bündel bilden.
Seit kurzem ist das Steuerungssignal Draxin als ein wichtiges repulsives Axon-Steuerungssignal bekannt. Es ist essentiell für die Bildung von Kommissuren des Rückenmarks und des Vorderhirns; eingeschlossen das Corpus Callosum. Draxin wird in verschiedenen Hirnregionen exprimiert: Cortex, Riechkolben, Mittelhirn und Cerebellum. Es inhibiert das Herauswachsen von Neuriten aus dem dorsalen Rückenmark, Riechkolben und corticalen Explantaten in vitro. Draxin vermittelt die Inhibition durch verschiedene Rezeptoren: DCC (deleted in colorectal cancer), Neogenin, UNC5s (H1, H2, H3) und DSCAM (Down’s syndrome cell adhesion molecule). Die molekularen Details der Draxin Wirkungsweise sind unbekannt.
Im ersten Teil meiner Arbeit habe ich untersucht wie MAP1B in Draxin und Semaphorin3A (Sema3A) induzierter Inhibition des Neuritenauswuches sowie dem Zusammenbruch von Wachstumskegeln involviert ist. Zur Beantwortung dieser Fragen habe ich zwei Versuchsansätze etabliert. Zur Untersuchung des Neuritenauswuchses wurden zerebrale kortikale Explantate verwendet. Der Zusammenbruch von Wachstumskegeln wurde mittels dissoziierter kortikaler Neuronen untersucht. Die Versuche deuteten darauf hin das Draxin und Sema3A Signalwege von MAP1B abhängen. Mit Hilfe von genetischen und pharmakologischen Experimenten habe ich herausgefunden das Draxin induzierter Zusammenbruch von Wachstumskegeln stark von Draxinrezeptoren abhängt (DCC), sowie abhängig ist von der Proteinkinase Akt und Aktivierung von GSK-3β (Glykogen Synthase Kinase-3 β). Diese wiederum korreliert mit erhöhter Phosphorylierung von MAP1B. Die vorliegende Arbeit zeigt zum ersten Mal die molekularen Mechanismen welche der Draxin Repulsion zugrunde liegen. Sie stellt den Zusammenhang her zwischen Draxin und DCC mit MAP1B und beinhaltet die Identifizierung eines neuen GSK-3β Signalweges, welcher essentiell ist für repulsive Axonsteuerung. Zusätzlich habe ich den Effekt von Draxin auf die Polarisierung von dissoziierten kortikalen Neuronen und den Effekt von Sema3A auf die Verzweigung von pyramidalen Neuronen untersucht.
Im zweiten Teil meiner Arbeit habe ich mir die Rolle von Myosin in Stickoxid-induzierter Axon Repulsion in Mausneuroblastomazelllinien (N2a) angeschaut. Mysosin ist ein Motor Protein welches in die Aktin-Mysosin Kontraktion involviert ist. Unter Verwendung von biochemischen Versuchen habe ich die Mono-Phosphorylierung der MRLC (myosin regulatory light chain) an Serin 19 als Indikator für Myosin Aktivität angesehen. N2a Zellen wurden mit SNAP, einem Stickoxid (NO) Donor, behandelt. Der Anstieg der Phosphorylierung wurde partiell inhibiert durch den ROCK Inhibitor Y27632. ROCK ist eine Rho-assozierte Kinase. Das Ergebnis deutet darauf hin das ROCK eine Schlüsselrolle zukommt in Myosinaktivierung als Reaktion auf die SNAP Behandlung. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse das Myosin wichtig ist für die Axon Repulsion induziert durch NO.

During neuronal development axons respond to an array of signals to navigate to their targets. Growth cones at the tip of the axons choose their path with the aid of extracellular guidance cues. They are composed of finger like projections, filopodia and veil like structure called lamellipodia. Cues can either attract or repel growth cones. Extracellular cues are the molecules that are secreted or presented on the cell surface by cells along the axon path including netrin, semaphorins, slits and ephrins. These guidance cues regulate growth cone advance, turning, and branching behaviours of the growth through cytoskeleton rearrangements.
Growth cone dynamics is regulated by two cytoskeleton components, actins and microtubules (MTs). MTs are extremely dynamic structures, involved in neurite extension, retraction and polarity. The dynamics of microtubule is regulated by Microtubule associated protein 1B (MAP1B), a class of proteins which bind along the MTs and regulate their function in growth and guidance. MAP1B KO display various defects including agenesis of corpus callosum, misguided commisural forming probst bundles.
Recently known guidance cue draxin is an important repulsive axon guidance cue essential for the formation of spinal cord and forebrain commissures, including corpus callosum. Draxin is expressed in various brain regions including, cortex, olfactory bulb, midbrain and cerebellum. It inhibits the neurite outgrowth from dorsal spinal cord, olfactory bulb and cortical explants in vitro. Draxin induces neurite outgrowth inhibition through multiple netrin receptors: DCC (deleted in colorectal cancer), Neogenin, UNC5s (H1, H2, H3), and DSCAM (Down's syndrome cell adhesion molecule) but the molecular details of draxin signaling are unknown.
In the first part of my thesis I examined the involvement of MAP1B in draxin and Semaphorin3A (Sema3A) induced neurite outgrowth inhibition and growth cone collapse. In order to address these questions, I established two assays. For neurite out growth assay cerebral cortical explants were used whereas for growth cone collapse assay dissociated cortical neurons were used.
These assays suggested that draxin and Sema3A signaling is dependent on MAP1B. Using genetic and pharmacological approaches I found that draxin-induced growth cone collapse critically depends on draxin receptors (deleted in colorectal cancer, DCC), inhibition of protein kinase Akt and activation of GSK-3β (glycogen synthase kinase-3β) which correlates with increased phosphorylation of MAP1B. This study, for the first time reveals molecular mechanisms involved in draxin repulsion, links draxin and DCC to MAP1B and identifies a novel MAP1B-depenent GSK-3β pathway essential for repulsive axon guidance. Additionally, I studied the effect of draxin on polarization of dissociated cortical neurons and the effect of Sema3A on branching of pyramidal neurons.
In the second part of my study I investigated the role of myosin in nitric oxide induced axon retraction in mouse neuroblastoma (N2a) cell lines. Myosin is motor protein involved in the acto-myosin contractility. Using biochemical assay I analyzed the monophosphorylation of the myosin regulatory light chain (MRLC) at Ser19 as an indicator of the myosin activity. N2a cells were treated with SNAP, a Nitric oxide (NO) donor. Treatment of SNAP enhanced the monophosphorylation of the MRLC. The increase in phosphorylation was partially inhibited by the rho-associated, coiled-coil-containing protein kinase (ROCK) inhibitor Y27632, suggesting that ROCK is the key to myosin activation in response to SNAP. These results demonstrated that myosin is important for the axon retraction induced by NO.