Die kovalente Anbindung von Ubiquitin an Proteine spielt eine grosse Rolle in vielen biologischen Prozessen. Daher ist die korrekte Abfolge der enzymatischen Ubiquitinierungskaskade besonders wichtig. Zu Beginn wird Ubiquitin durch eine E1 Ligase aktiviert und an ein E2 Ubiquitin-konjugierendes Enzym weiter gegeben (E2~Ub). Der E2~Ub Komplex bindet anschliessend an eine E3 Ligase, die durch die Bindung eines Substrat, den Ubiquitintransfer vom E2~Ub Komplex an das Substrat ermöglicht. Obwohl die einzelnen Prozesse der Ubiquitinierung einfach erscheinen, ist der detailierte molekulare Prozess relative schlecht charakterisiert. Aufgrund ihrer Aktivität werden die E3 Ligasen in verschieden Klassen aufgeteilt: HECT, RING, RING-IBR-RING und die bakteriellen Orthologen. Der Anaphase Promoting Complex/Cyclosome (APC/C), eine E3 Ligase der RING Familie, spielt eine besonders wichtige Rolle im Zellzyklus, besonders während der Mitose. Sie ist verantwortlich für die Ubiquitinierung von Sekurin und B-typ spezifischen Zyklinen. Sekurin ist ein Inhibitor der Cohesin Protease Separase und B-typ spezifische Zykline aktivieren die Zyklin abhängige Kinase 1 (CDK1). Durch deren Inaktivierung wird der korrekte Ausgang der Mitose sichergestellt und unter anderem auch die schnelle Aufteilung der Sisterchromatiden auf die zwei Tochterzellen. Der APC/C Komplex wird indirekt durch UBE2S aktiviert. UBE2S führt zur Lysin 11 Ubiquitinkettenbildung auf der E2 Ligase, UBCH10. Diese Kettenbildung wird dann zur Ubiquitinierung von Sekurin und B-typ spezifischen Zyklinen durch den APC/C Komplex weiter verwendet. Das Ziel meiner Doktorarbeit ist die Aktivierung des APC/C Komplexes besser zu verstehen. Wie wird UBE2S an APC/C gebunden? Welche Aminosäuren sind dabei besonders wichtig? Zu diesem Zweck wurde die Interaktionsfähigkeit von UBE2S Mutanten an APC/C mit Hilfe von “Co-IP” Experimenten analysiert und Mutationen im C-Terminus haben sich dabei als essentiell erwiesen. In anderen Experimenten wurde die Funktionalität der Interaktionsoberfläche von UBE2S mittels Alanin Mutationen getestet. Mehrere, unerwartete Mutationen weisen auf eine wichtige Funktion in der APC/C abhängigen Ubiquitinkettenformation hin. Ein weiterer wichtiger Punkt in der Ubiquitinierungskaskade ist die Substratbindung. APC/C benötigt dazu die Hilfe von einem der beiden Zellzykus spezifischen Kofaktoren, CDH1 oder CDC20. APC/C gebundene Kofaktoren erkennen spezielle Abbaumotife in Substratproteinen mit Hilfe ihres C-terminalen β-Propellers. Um diesen Prozess besser verstehen zu können, verwendete ich ein Hefe spezifisches Modelprotein, Hsl1, das besonders gut an CDH1 bindet. Um eine hochauflösende Proteinstrukturen dieser Interaktion zu erhalten, wurden Kristallisierungsexperimente mit CDH1 und synthetischen Hsl1 D-Box Peptiden angesetzt. In anderen Kristallisierungsversuchen wurden CDH1 und Hsl1 Fragmenten, die sowohl die D- als auch KEN-Box enthalten, in Insektzellen ko-exprimiert. Um herauszufinden wie sehr das D-Box bzw. KEN-Box Motif die Bindung an die Kofaktoren beeinflussen, habe ich zusätzlich Isothermal Titration Calorimetry (ITC) Experimenten durchgeführt. Die Hsl1 D-Box scheint mit einer dreifach höheren Affinität an den CDH1 β-Propeller zu binden als die KEN-Box. Daraus schliesse ich, dass die D-Box besonders wichtig ist für die korrekte CDH1 abhängige Rekrutierung von Proteinsubstraten an den APC/C Komplex.

Ubiquitination boasts widespread importance in a multitude of cellular signalling events. It utilises a tri-enzyme cascade consisting of an E1 ubiquitin activating enzyme, an E2 ubiquitin conjugating enzyme and an E3 ligase to covalently attach ubiquitin to target substrate proteins. The cascade can be broken down into three main principles: 1: recruitment of an E2~Ub species to the E3, 2: recruitment of the substrate to the E3 and 3: activation of the donor ubiquitin on the E2. Despite the apparent simplicity of the ubiquitination cascade, the full molecular details of how an E3 facilitates transfer of ubiquitin to a substrate still remain elusive. E3s can be classified according to their mechanism; these include the RING, HECT, RINGIBR- RING and bacterial families of E3 ligases. This thesis will focus on the RING E3 ligase the Anaphase Promoting Complex/Cyclosome (APC/C). The ubiquitin ligase activity of the APC/C is essential for rapid sister chromatid separation and mitotic exit. The APC/C initiates these events by ubiquitinating securin, an inhibitor of the cohesin cleaving protease separase, and B-type cyclins, the activating subunits of cyclin-dependent kinase 1 (CDK1). These ubiquitination events are initiated by the E2 UBCH10 with subsequent K11 linked ubiquitin chains built by UBE2S. We set out to understand the first two principles of the APC/C ubiquitination cascade: how UBE2S is recruited to the APC/C and the residues of UBE2S that are important for its function. To address this, we assessed the ability of UBE2S mutants to stably bind the APC/C. The C-terminal tail residues were essential to recruit UBE2S to the APC/C. Furthermore, we performed a surface alanine scan of UBE2S to identify residues and surfaces important for the function of UBE2S. Several residues were identified on an unexpected surface that were essential for APC/C dependant ubiquitin chain formation. The third principle of the ubiquitination cascade is the recruitment of the substrate to the E3. The APC/C recognises its substrates through one of two cell cycle stage specific coactivator proteins, CDH1 and/or CDC20. The C-terminal WD-40 domain of these co-activators recognise specific degradation motifs within substrates. To understand at a molecular level how this is achieved we initiated structural studies using as a model substrate the yeast protein Hsl1, which is known to bind tightly to CDH1. Crystallography trials were conducted with CDH1 and a synthetic Hsl1 D-box peptide, as well as with CDH1 co-expressed with a Hsl1 fragment containing both a D-box and a KEN-box. Furthermore, we used Isothermal Titration Calorimetry (ITC) to understand the relative contribution of D-boxes and KEN-boxes to coactivator binding. These experiments revealed that the Hsl1 D-box binds to the CDH1 WD40 domain with a 3-fold higher affinity than the KEN-box, indicating that interactions with the Dbox are of particular importance for CDH1 to be able to recruit substrates to the APC/C.