Title (eng)
Targeted therapy of bladder cancer and other urothelial diseases
developing novel bioassays for analytical characterization and optimization of glyco-recognitive drug delivery systems
Parallel title (deu)
Zielgerichtete Therapie von Blasentumor und anderen urothelialen Erkrankungen ; Entwicklung neuer Bioassays zur analytischen Charakterisierung und Optimisierung von glyco-rekognitiven Arzneimittelab
Author
Alexandra Hofer
Advisor
Michael Wirth
Assessor
Michael Wirth
Abstract (deu)
Erkrankungen der Blase, wie Blasenkrebs oder Harnwegsinfektionen, sind weit verbreitet und zeigen ernstzunehmende Mängel bei lokaler Therapie, zum Beispiel aufgrund von Auswaschungen der eingesetzten Medikation durch konstante Urinproduktion. Außerdem zeigen Erkrankungen der Blase eine hohe Wahrscheinlichkeit für die Ausbildung von Rezidiven, welchen man mit neuen Systemen zur zielgerichteten Medikamentenabgabe über einen Rezeptor entgegenwirken will. Obwohl das Urothelium der Blase eine der stärksten biologischen Barrieren darstellt, konnte bereits anhand von malignen Urothelzellen (5637) eine erfolgreiche Zelladhesion bzw -invasion des Lektins WGA festgestellt werden. Eine Oberflächenmodifikation von PLGA Nano- oder Mikropartikeln (NP/MP) mit WGA könnte somit eine geeignetes System für die gezielte Aufnahme in die Zelle über einen Rezeptor darstellen. Um eine erfolgreiche Zellinvasion dieser modifizierten Partikel, welche zuvor mit der geeigneten Medikation beladen wurden, beweisen zu können, braucht es eine robuste Detektionsmethode, welche eine eindeutige Unterscheidung zwischen intrazellulärer und extrazellulärer Fracht ermöglicht. Um dies zu erreichen, wurden in dieser Arbeit drei verschiedene Methoden evaluiert, entweder mit Hilfe von Biokonjugaten (z.B. WGA gebunden an ein fluoreszierendes Molekül) oder NP/MP, welche vorher mit WGA oberflächenmodifiziert wurden.
Der TMB Assay wurde mit Hilfe einer Vielzahl an MP evaluiert, welche sich durch die Menge an oberflächlich-gebundenem Biotin unterschieden. Diese unterschiedlichen Biotinmengen sollten zu einer verbesserten und intensivieren Interaktion zwischen Avidin – gebunden an Meerrettichperoxidase (HRP) für die spätere Detektion mittels TMB – und dem an der MP-Oberfläche assoziiertem Biotin führen. Die MP wurden entweder nur mittels Biotin-markiertem WGA (b-WGA), oder zusätzliche mit BIO C5 NHS in geringerer (bb-WGA) oder höherer (bbb-WGA) Konzentration modifiziert. Die Ergebnisse zeigten eine Verbesserung des erreichten Signals über den stetigen Anstieg von Avidin-zugänglichem Biotin auf der MP Oberfläche. Insgesamt blieb die erreichte Signalhöhe jedoch stark unter dem Level, welches zur Unterscheidung zwischen Zelladhäsion und Zellinvasion benötigt wird. Weiters wurden MP nun direkt mit HRP und HRP/WGA konjugiert, was sich sowohl in erfolgreicher MP Oberflächenmodifikation also auch in einer Steigerung des TMB Signals als vielversprechend erwies. Dennoch stellte sich diese Methode als mangelhaft heraus, da ein nicht näher untersuchtes Phänomen auftrat, welches man eventuell als Enzymsättigung beschreiben könnte. Diese Störung der enzymatischen Reaktion bedarf weiterer Nachforschungen, die in diesem Zusammenhang nicht durchgeführt wurden.
Für die zweite Detektionsmethode wurde ein sogenanntes Tyramid Signal Amplification (TSA) Kit verwendet, welches dazu dient HRP (konjugiert an WGA oder MP) sichtbar zu machen. Dabei kommt es zu einer enzymatischen Reaktion zwischen einem fluoreszenz-markiertem Tyramide und HRP, welche zur Bildung eines Tyramid-Radikals führt, das nun eine kovalente Bindung mit nukleophilen Bereichen auf der Zelle eingeht und somit detektierbar wird. Die Analyse dieser Methode mittels Mikroskop zeigte sich erfolgreich unter Verwendung eines Biokonjugates (hrp-WGA); erlaubte also eine klare Unterscheidung zwischen intrazellulär und extrazellulär gebundenem Lektin, welche durch die Undurchlässigkeit der Zellmembran für Tyramid ermöglicht wurde. Leider erwies sich diese Methode als unzureichend für die Anwendung an modifizierten MP (HRP MP) und für quantitative Detektionsmethoden (Fluorimetrie via Tecan Infinite® 200 Reader).
Die letzte Methode, die in dieser Arbeit evaluiert wurde, basiert auf der Fähigkeit von TCEP verschiedene fluoreszierende Moleküle zu quenchen, und erwies sich auch als die vielversprechendste Detektionsmethode. Der TCEP Assay wurde unter Verwendung verschiedener Detektionsapparaturen (Fluoreszenzmikroskop, Fluorimetrie via Tecan Infinite® 200 Reader und Flowcytometer) erfolgreich angewendet und optimiert. Außerdem konnte die Anwendbarkeit des Assays sowohl auf Biokonjugate (a647-WGA) als auch NP demonstriert werden. Das Prinzip der Unterscheidung zwischen zelladhärenter und zellinvasiver Fracht beruht auf der Undurchlässigkeit der Zellmembran für TCEP und konnte durch Permeabilisation der Zelle als Kontrollversuch verifiziert werden. Aufgrund von Schwierigkeiten bei der Oberflächenmodifikation der NP konnte auch mit Hilfe des TCEP Assays keine klare Aussage über Internalisation der Partikel in Blasenzellen (5637) erreicht werden. Nichtsdestotrotz stellt die neu etablierte Detektionsmethode via TCEP Quenching eine geeignete Möglichkeit zur Unterscheidung von Fracht innerhalb und außerhalb der Zelle dar und könnte somit für weitere Untersuchungen auf dem Gebiet der Analyse von Endocytose hilfreich sein.
Abstract (eng)
Bladder diseases like bladder cancer (BCa) or urinary tract infection are prevalent and show severe shortcomings in the localized therapy, e.g. due to the elution of the utilized drugs by constant urine production. Furthermore, bladder diseases show high relapse incidents which might be overcome by new receptor-targeted drug delivery systems that are able to overcome the bladder urothelium, which is one of the hardest biological barriers to penetrate. In malignant urothelial cells (5637) the lectin wheat germ agglutinin (WGA) has found to be a promising candidate to trigger receptor-targeted cytoinvasion of conjugated cargo like nano- or microparticles (NP/MP). In order to prove successful cellular uptake of particles, which are loaded with the drug needed for therapy, a robust method for detection and characterization of endocytosis is necessary. For this, three different methods were evaluated in this work either with bioconjugates (e.g. WGA labelled with a fluorescent molecule) or with NP/MP, which were previously conjugated to labelled WGA.
The TMB assay was evaluated using a panel of MP variants, which differed concerning the amount of particle-associated Biotin, aiming to improve and intensify the interaction between Avidin, conjugated to horseradish peroxidase (HRP) for further detection via the TMB assay, and Biotin, immobilized at the MP surface. The MP variants consisted of PLGA MP either modified with Biotin-labelled WGA (b-WGA) only, additionally biotinylated with BIO C5 NHS (bb-WGA) or hyperbiotinylated (bbb-WGA) MP. Although the constant increase in the Avidin-accessible Biotin with every MP variant resulted in an improvement of the intensity of the recorded signals, the overall signal level remained too low to allow for a clear analysis of a possible cellular uptake of the particles. Direct modification of the MP surface with HRP or HRP/WGA was successful and showed an increase of the signal level with TMB to the required level for endocytosis detection. However, potential saturation phenomena or other disturbances of the enzyme reaction point to additional processes that may go on during TMB development and require further research.
For the second method a tyramide signal amplification (TSA) kit was used, which should visualize HRP (conjugated to WGA or MP surfaces) through an enzymatic reaction with fluorescence-labelled tyramide and successive covalent binding of this tyramide to nearby accessible reactive groups at the cell. Assessment of this method for bioconjugates (hrp-WGA) resulted in a successful discrimination between cytoadhesive and cytoinvasive cargo due to the impenetrability of the cell membrane for the tyramide, but only for qualitative detection (fluorescence microscopy). Unfortunately, the TSA assay showed limitations concerning the applicability for modified MP (HRP MP) and quantitative detection (fluorimetry via Tecan Infinite® 200 Reader).
The last evaluated method, based on the quenching ability of TCEP for several fluorescent molecules, turned out to be the most promising detection method assessed in this work. The assay could be applied and optimized for different detection devices, and for generating both qualitative and quantitative results (fluorescence microscopy, fluorimetry via Tecan Infinite® 200 Reader and flow cytometry). Moreover, applicability for bioconjugates (a647-WGA) as well as NP could be demonstrated. The discrimination between cytoadhesive and cytoinvasive cargo could be achieved due to the impenetrability of the cell membrane for TCEP, which was verified in control assays via cell permeabilization. Nevertheless a clear prove of successful internalization of NP in 5637 BCa cells could not be achieved yet, because of difficulties in the surface modification of NP. However, the established detection method via TCEP quenching is suitable for discrimination between cytoadhesive and cytoinvasive cargo and therefore, might be applied for further research in endocytosis analysis.
Keywords (eng)
Bladder cancernew drug delivery systemsendocytosis
Keywords (deu)
Blasentumorneue ArzneimittelabgabesystemeEndocytose
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1311201
rdau:P60550 (deu)
120 S. : Ill., graph. Darst.
Number of pages
120
Association (deu)
Title (eng)
Targeted therapy of bladder cancer and other urothelial diseases
developing novel bioassays for analytical characterization and optimization of glyco-recognitive drug delivery systems
Parallel title (deu)
Zielgerichtete Therapie von Blasentumor und anderen urothelialen Erkrankungen ; Entwicklung neuer Bioassays zur analytischen Charakterisierung und Optimisierung von glyco-rekognitiven Arzneimittelab
Author
Alexandra Hofer
Abstract (deu)
Erkrankungen der Blase, wie Blasenkrebs oder Harnwegsinfektionen, sind weit verbreitet und zeigen ernstzunehmende Mängel bei lokaler Therapie, zum Beispiel aufgrund von Auswaschungen der eingesetzten Medikation durch konstante Urinproduktion. Außerdem zeigen Erkrankungen der Blase eine hohe Wahrscheinlichkeit für die Ausbildung von Rezidiven, welchen man mit neuen Systemen zur zielgerichteten Medikamentenabgabe über einen Rezeptor entgegenwirken will. Obwohl das Urothelium der Blase eine der stärksten biologischen Barrieren darstellt, konnte bereits anhand von malignen Urothelzellen (5637) eine erfolgreiche Zelladhesion bzw -invasion des Lektins WGA festgestellt werden. Eine Oberflächenmodifikation von PLGA Nano- oder Mikropartikeln (NP/MP) mit WGA könnte somit eine geeignetes System für die gezielte Aufnahme in die Zelle über einen Rezeptor darstellen. Um eine erfolgreiche Zellinvasion dieser modifizierten Partikel, welche zuvor mit der geeigneten Medikation beladen wurden, beweisen zu können, braucht es eine robuste Detektionsmethode, welche eine eindeutige Unterscheidung zwischen intrazellulärer und extrazellulärer Fracht ermöglicht. Um dies zu erreichen, wurden in dieser Arbeit drei verschiedene Methoden evaluiert, entweder mit Hilfe von Biokonjugaten (z.B. WGA gebunden an ein fluoreszierendes Molekül) oder NP/MP, welche vorher mit WGA oberflächenmodifiziert wurden.
Der TMB Assay wurde mit Hilfe einer Vielzahl an MP evaluiert, welche sich durch die Menge an oberflächlich-gebundenem Biotin unterschieden. Diese unterschiedlichen Biotinmengen sollten zu einer verbesserten und intensivieren Interaktion zwischen Avidin – gebunden an Meerrettichperoxidase (HRP) für die spätere Detektion mittels TMB – und dem an der MP-Oberfläche assoziiertem Biotin führen. Die MP wurden entweder nur mittels Biotin-markiertem WGA (b-WGA), oder zusätzliche mit BIO C5 NHS in geringerer (bb-WGA) oder höherer (bbb-WGA) Konzentration modifiziert. Die Ergebnisse zeigten eine Verbesserung des erreichten Signals über den stetigen Anstieg von Avidin-zugänglichem Biotin auf der MP Oberfläche. Insgesamt blieb die erreichte Signalhöhe jedoch stark unter dem Level, welches zur Unterscheidung zwischen Zelladhäsion und Zellinvasion benötigt wird. Weiters wurden MP nun direkt mit HRP und HRP/WGA konjugiert, was sich sowohl in erfolgreicher MP Oberflächenmodifikation also auch in einer Steigerung des TMB Signals als vielversprechend erwies. Dennoch stellte sich diese Methode als mangelhaft heraus, da ein nicht näher untersuchtes Phänomen auftrat, welches man eventuell als Enzymsättigung beschreiben könnte. Diese Störung der enzymatischen Reaktion bedarf weiterer Nachforschungen, die in diesem Zusammenhang nicht durchgeführt wurden.
Für die zweite Detektionsmethode wurde ein sogenanntes Tyramid Signal Amplification (TSA) Kit verwendet, welches dazu dient HRP (konjugiert an WGA oder MP) sichtbar zu machen. Dabei kommt es zu einer enzymatischen Reaktion zwischen einem fluoreszenz-markiertem Tyramide und HRP, welche zur Bildung eines Tyramid-Radikals führt, das nun eine kovalente Bindung mit nukleophilen Bereichen auf der Zelle eingeht und somit detektierbar wird. Die Analyse dieser Methode mittels Mikroskop zeigte sich erfolgreich unter Verwendung eines Biokonjugates (hrp-WGA); erlaubte also eine klare Unterscheidung zwischen intrazellulär und extrazellulär gebundenem Lektin, welche durch die Undurchlässigkeit der Zellmembran für Tyramid ermöglicht wurde. Leider erwies sich diese Methode als unzureichend für die Anwendung an modifizierten MP (HRP MP) und für quantitative Detektionsmethoden (Fluorimetrie via Tecan Infinite® 200 Reader).
Die letzte Methode, die in dieser Arbeit evaluiert wurde, basiert auf der Fähigkeit von TCEP verschiedene fluoreszierende Moleküle zu quenchen, und erwies sich auch als die vielversprechendste Detektionsmethode. Der TCEP Assay wurde unter Verwendung verschiedener Detektionsapparaturen (Fluoreszenzmikroskop, Fluorimetrie via Tecan Infinite® 200 Reader und Flowcytometer) erfolgreich angewendet und optimiert. Außerdem konnte die Anwendbarkeit des Assays sowohl auf Biokonjugate (a647-WGA) als auch NP demonstriert werden. Das Prinzip der Unterscheidung zwischen zelladhärenter und zellinvasiver Fracht beruht auf der Undurchlässigkeit der Zellmembran für TCEP und konnte durch Permeabilisation der Zelle als Kontrollversuch verifiziert werden. Aufgrund von Schwierigkeiten bei der Oberflächenmodifikation der NP konnte auch mit Hilfe des TCEP Assays keine klare Aussage über Internalisation der Partikel in Blasenzellen (5637) erreicht werden. Nichtsdestotrotz stellt die neu etablierte Detektionsmethode via TCEP Quenching eine geeignete Möglichkeit zur Unterscheidung von Fracht innerhalb und außerhalb der Zelle dar und könnte somit für weitere Untersuchungen auf dem Gebiet der Analyse von Endocytose hilfreich sein.
Abstract (eng)
Bladder diseases like bladder cancer (BCa) or urinary tract infection are prevalent and show severe shortcomings in the localized therapy, e.g. due to the elution of the utilized drugs by constant urine production. Furthermore, bladder diseases show high relapse incidents which might be overcome by new receptor-targeted drug delivery systems that are able to overcome the bladder urothelium, which is one of the hardest biological barriers to penetrate. In malignant urothelial cells (5637) the lectin wheat germ agglutinin (WGA) has found to be a promising candidate to trigger receptor-targeted cytoinvasion of conjugated cargo like nano- or microparticles (NP/MP). In order to prove successful cellular uptake of particles, which are loaded with the drug needed for therapy, a robust method for detection and characterization of endocytosis is necessary. For this, three different methods were evaluated in this work either with bioconjugates (e.g. WGA labelled with a fluorescent molecule) or with NP/MP, which were previously conjugated to labelled WGA.
The TMB assay was evaluated using a panel of MP variants, which differed concerning the amount of particle-associated Biotin, aiming to improve and intensify the interaction between Avidin, conjugated to horseradish peroxidase (HRP) for further detection via the TMB assay, and Biotin, immobilized at the MP surface. The MP variants consisted of PLGA MP either modified with Biotin-labelled WGA (b-WGA) only, additionally biotinylated with BIO C5 NHS (bb-WGA) or hyperbiotinylated (bbb-WGA) MP. Although the constant increase in the Avidin-accessible Biotin with every MP variant resulted in an improvement of the intensity of the recorded signals, the overall signal level remained too low to allow for a clear analysis of a possible cellular uptake of the particles. Direct modification of the MP surface with HRP or HRP/WGA was successful and showed an increase of the signal level with TMB to the required level for endocytosis detection. However, potential saturation phenomena or other disturbances of the enzyme reaction point to additional processes that may go on during TMB development and require further research.
For the second method a tyramide signal amplification (TSA) kit was used, which should visualize HRP (conjugated to WGA or MP surfaces) through an enzymatic reaction with fluorescence-labelled tyramide and successive covalent binding of this tyramide to nearby accessible reactive groups at the cell. Assessment of this method for bioconjugates (hrp-WGA) resulted in a successful discrimination between cytoadhesive and cytoinvasive cargo due to the impenetrability of the cell membrane for the tyramide, but only for qualitative detection (fluorescence microscopy). Unfortunately, the TSA assay showed limitations concerning the applicability for modified MP (HRP MP) and quantitative detection (fluorimetry via Tecan Infinite® 200 Reader).
The last evaluated method, based on the quenching ability of TCEP for several fluorescent molecules, turned out to be the most promising detection method assessed in this work. The assay could be applied and optimized for different detection devices, and for generating both qualitative and quantitative results (fluorescence microscopy, fluorimetry via Tecan Infinite® 200 Reader and flow cytometry). Moreover, applicability for bioconjugates (a647-WGA) as well as NP could be demonstrated. The discrimination between cytoadhesive and cytoinvasive cargo could be achieved due to the impenetrability of the cell membrane for TCEP, which was verified in control assays via cell permeabilization. Nevertheless a clear prove of successful internalization of NP in 5637 BCa cells could not be achieved yet, because of difficulties in the surface modification of NP. However, the established detection method via TCEP quenching is suitable for discrimination between cytoadhesive and cytoinvasive cargo and therefore, might be applied for further research in endocytosis analysis.
Keywords (eng)
Bladder cancernew drug delivery systemsendocytosis
Keywords (deu)
Blasentumorneue ArzneimittelabgabesystemeEndocytose
Subject (deu)
Type (deu)
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