Chlamydien sind eine Gruppe höchst erfolgreicher, obligat intrazellulärer Bakterien, die seit mehr als 700 Millionen Jahren mit eukaryotischen Wirtszellen assoziiert sind. Im Unterschied zu beinahe allen anderen Bakterien scheint der Zellhülle der Chlamydien eine stabilisierende und formgebende Peptidoglykanschicht zu fehlen. Stattdessen wird das Elementarkörperchen, das stabile, extrazelluläre und infektiöse Entwicklungsstadium der Chlamydien, durch eine starke Quervernetzung mittels Disulfidbrücken cysteinreicher Außenmembranproteine stabilisiert. Diese Disulfidbrücken werden nach Aufnahme der Elementarköperchen in die Wirtszelle reduziert, wodurch das flexiblere und labilere Retikularkörperchen entsteht, die metabolisch hochaktive und sich teilende Form der Chlamydien. Dieser typische Aufbau der Zellhülle und die damit verbundenen Prozesse wurden an Mitgliedern der Familie Chlamydiaceae untersucht, die seit über einem Jahrhundert bekannt ist und wichtige human- und tierpathogene Arten umfasst. Da Proteine in der Außenmembran der Chlamydiaceae großes Potential als Impfstoffkandidaten haben, wurde die Proteinzusammensetzung der Außenmembran sowie die häufigsten Proteine der Chlamydiaceae ausführlich untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Hauptkomponenten, das Porin MOMP und die beiden cysteinreichen Proteine OmcA und OmcB, in allen Arten der Chlamydiaceae konserviert sind. In den vergangenen zwei Jahrzehnten hat sich die bekannte Diversität der Chlamydien stark erhöht und neue Familien, die auch als „Umweltchlamydien“ zusammengefasst werden, wurden als Symbionten von Amöben, Insekten und Fischen entdeckt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden unterschiedliche Aspekte der Zellhülle einiger Vertreter dieser Umweltchlamydien untersucht. Unter Verwendung von Cryo-Elektronentomographie, einer Technik die die Visualisierung von Organismen ohne chemische Fixierung mit makromolekularer Auflösung erlaubt, konnten wir im Periplasma des Amöbensymbionten Protochlamydia amoebophila eine zusätzliche Schicht detektieren, die Peptidoglykan anderer Gram-negativer Bakterien ähnelt. Der Einbau von fluoreszent markiertem D-Alanin, einem essentiellen Bestandteil von Peptidoglykan, zeigte, dass P. amoebophila Peptidoglykan synthetisiert, und mittels Massenspektrometrie konnten Bestandteile von Peptidoglykan in aufgereinigten Sacculi nachgewiesen werden. Dies war der erste Nachweis von Peptidoglykan in einem Vertreter der Chlamydien. Interessanterweise zeigten massenspektrometrische Untersuchungen von Außenmembranproteinpräparationen von Mitgliedern dreier unterschiedlicher Chlamydienfamilien, dass nicht alle Chlamydien cysteinreiche Proteine zur Stabilisierung der Zellhülle besitzen. In Abwesenheit dieser Proteine wird Simkania negevensis im Gegensatz zu anderen Chlamydien auch nicht durch das Reduktionsmittel Dithiothreitol destabilisiert. Auch hinsichtlich des häufigsten Porins in der Außenmembran gibt es Unterschiede zwischen den Chlamydienfamilien. Die Außenmembran von S. negevensis und Waddlia chondrophila wird von großen Familien MOMP-ähnlicher Proteine dominiert. Im Gegensatz dazu sind MOMP-Homologe in Mitgliedern der Parachlamydiaceae entweder nicht (P. amoebophila) oder nur in sehr geringen Mengen (Parachlamydia acanthamoebae) in der Außenmembrane vorhanden. Stattdessen dominieren hypothetische Proteine die Außenmembran dieser Organismen, für die in silico die Bildung von Beta-Barrel-Strukturen, ein Merkmal von Porinen, vorhergesagt wurde. Durch die Charakterisierung der zwei häufigsten Vertreter dieser Proteine in P. amoebophila konnten wir zeigen, dass diese tatsächlich in der Außenmembran lokalisiert sind. Darüberhinaus konnte für eines der Proteine auch die Funktion als Porin nachgewiesen werden. Um über die Barriere der Zellhülle und die Membran der Vakuole, in der sich Chlamydien in der Wirtszelle befinden, Effektorproteine in die Wirtszelle zu sekretieren verwenden Chlamydien Typ-III- Sekretionssysteme, wodurch beispielsweise Organellen der Wirtszelle zur Vakuole rekrutiert werden. Unter Verwendung von Cryo-Elektronentomographie konnten wir erstmals Typ-III-Sekretionssysteme von Umweltchlamydien visualisieren und zudem zeigen, dass S. negevensis ähnlich wie Chlamydia trachomatis das endoplasmatische Retikulum der Wirtszelle zur Vakuole rekrutiert. All dies zeigt, dass einige Komponenten, wie das Typ-III-Sekretionssystem, in Mitgliedern verschiedener Chlamydienfamilien konserviert sind und somit für die erfolgreiche Infektion eukaryotischer Zellen durch Chlamydien notwendig sind. Die Diversität in der Proteinzusammensetzung der Außenmembran sowie die Fähigkeit einiger Chlamydien Wirtszellorganellen zu rekrutieren stellt hingegen eine Anpassung an unterschiedliche Wirte dar und trägt damit zu dem immensen Wirtsspektrum dieser Bakterien bei.

Chlamydiae are a group of highly successful obligate intracellular bacteria that have been associated with eukaryotes for more than 700 million years. In contrast to most other bacteria, chlamydiae seemed to lack the stabilizing peptidoglycan layer that helps bacterial cells to retain their shape. Instead, the cell envelope of the elementary body, the stable, extracellular and infectious developmental stage of chlamydiae, is stabilized by disulfide-bridges formed between cysteine-rich proteins. These disulfide-bridges are reduced after uptake by the host cell, which results in the more flexible, labile reticulate body that represents the metabolically highly active and dividing form. The cell envelope and the changes it undergoes during the chlamydial developmental cycle were investigated almost exclusively in members of the Chlamydiaceae, a family that includes important human and animal pathogens and has been studied for more than a century. The major outer membrane protein MOMP, a porin, and the two cysteine-rich proteins OmcA and OmcB were found to dominate the outer membrane of all investigated Chlamydiaceae. In the last decade, the diversity of chlamydiae was discovered to be much larger than previously assumed and several families, collectively termed “environmental chlamydiae”, inhabiting amoebae, insects and fish were added to the phylum Chlamydiae. In this thesis I investigated selected aspects of the cell envelope of members of these environmental chlamydiae in order to identify conserved themes and variations. By the use of cryo-electron tomography, which allows the imaging of samples at macromolecular resolution without the need for chemical fixation or dehydration, we discovered a periplasmic layer reminiscent of peptidoglycan of Gram-negative bacteria in the cell envelope of the amoeba symbiont Protochlamydia amoebophila. P. amoebophila was shown to incorporate fluorescently labeled D-alanine, and peptidoglycan subunits were detected in purified sacculi by mass spectrometry. The detection of peptidoglycan in chlamydiae for the first time proves that at least some chlamydiae use the nearly complete peptidoglycan pathway, which is present in all chlamydial genomes. Interestingly, the cysteine-rich proteins suggested to stabilize chlamydiae in the absence of peptidoglycan are not present in all chlamydiae. No cysteine-rich proteins were detected in outer membrane protein fractions of Simkania negevensis by mass spectrometry, and in agreement with this the stability of this organism is not affected by reducing agents under low osmolarity conditions in contrast to other chlamydiae. The analysis of outer membrane protein fractions also showed differences in the most abundant porins in different chlamydial families. Large MOMP-like protein families dominate the outer membrane of S. negevensis and Waddlia chondrophila. In contrast, MOMP-homologues are either absent (P. amoebophila) or only present in low amounts (Parachlamydia acanthamoebae) in members of the Parachlamydiaceae. Instead, hypothetical proteins, for which beta barrel formation was predicted by in silico analysis, are the most abundant proteins in these organisms. The characterization of the dominant protein family in P. amoebophila proved indeed the localization in the outer membrane and a porin function for one of the two most abundant proteins, PomS. Finally, we visualized type III secretion structures of environmental chlamydiae for the first time by cryo-electron tomography. These secretion systems are encoded in the genomes of all chlamydiae and are used to secrete effector proteins into the host cell where they for example initiate the recruitment of host cell organelles to the chlamydia-containing vacuole. Similar to C. trachomatis, we observed recruitment of the endoplasmic reticulum by Simkania negevensis, showing that this host cell organelle manipulation is conserved between members of the pathogenic and environmental chlamydiae. Differences in the outer membrane composition and the ability to recruit host cell organelles of some chlamydiae likely represent adaptions to different hosts and thereby contribute to the large host spectrum of chlamydiae, while conserved components like the type III secretion system are indispensable for the infection of all eukaryotic hosts and evolved early on, laying the foundation for the success of chlamydiae as obligate intracellular pathogens and symbionts.