Die Neuromuskuläre Junction (NMJ) stellt die Verbindung zwischen einem Alpha Motorneuron und einem Muskel dar. Diese cholinerge Synapse wird während der Embryonal- und frühen Postnatalentwicklung gebildet und ist durch die hohe Anreicherung von Acetylcholinrezeptoren (AChR) charakterisiert. Erreicht ein Aktionspotential die Motorendplatte, wird Acetylcholin vom Nerv ausgeschüttet und bindet an AChR an der Muskelmembran, wodurch eine Muskelkontraktion ausgelöst wird. Erkrankungen der NMJ werden als myasthenische Syndrome beschrieben und reichen von Muskelschwäche bis hin zur Atemlähmung. Die Bildung und Aufrechterhaltung dieser hoch spezialisierten Struktur basiert auf Signalkaskaden, welche vorwiegend von der “muskel-spezifischen Kinase” (MuSK) initiiert werden. Während der Innervierung wird Agrin vom Nerv ausgeschüttet, wodurch vorgeformte AChR-Cluster gestärkt werden. Agrin bindet an “low density lipoprotein receptor related protein 4” (Lrp4) in der Muskelmembran, induziert dadurch die Autophosphorylierung der Kinase-Domäne von MuSK und somit die Aggregierung von AChR. Außerdem wird die Aktivierung von MuSK als Signal für Endozytose gewertet. Studien belegen, dass verwandte Rezeptor Tyrosin Kinasen auch nach Endozytose weiter aktiv sind. Daher sind Mechanismen, welche Internalisierung und Sortierung von MuSK kontrollieren von besonderem Interesse. Das erste Ziel dieser Masterarbeit war die Entwicklung eines heterologen Modelsystems des Agrin-Lrp4-MuSK Signalweges, da Versuche an differenzierten Muskelzellen durchaus komplex sind. MuSK und Lrp4 Proteine wurden unter der Verwendung von molekularbiologischen Methoden mit Tag-Sequenzen an deren extrazellulären Domänen fusioniert. Dadurch sollte eine spezifische Proteindetektion in biochemischen und immunzytochemischen Analysen ermöglicht werden. Obwohl dieses sogenannte „Tagging“ die Expression und Detektion der Proteine negativ beeinflusste, konnte die biologische Funktionalität bestätigt werden, da diese Fusionsproteine AChR-Clustering in Muskelzellen induzierten. Darauffolgend wurden Maus-Fibroblastenzellen mit einer retroviralen Methode dahingehend modifiziert, dass sie MuSK und Lrp4 Fusionsproteine stabil exprimieren. Zellpopulationen mit hoher Proteinexpression wurden mit magnet-aktivierter und fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung angereichert. Das zweite Ziel dieser Masterarbeit bezog sich auf die Analyse von MuSK-Endozytose im neu entwickelten Modelsystem. Endoztyose-Experimente zeigten, dass MuSK in einer Grundaktivität innerhalb von 5 Minuten internalisiert wird. MuSK wurde in frühe Endosomen aufgenommen und vorwiegend in multivesikuläre Körper sortiert, während Recycling eine geringere Rolle spielte. Lrp4 wies eine ähnliche Grundaktivität auf, wobei aber die Endozytosegeschwindigkeit erhöht und das Recycling über den Rab11 positiven Weg im Vergleich zu MuSK verstärkt wurde. In Kontrollexperimenten konnte ich feststellen, dass die Bindung von Antikörper beziehungsweise Ligand an deren Tag-Sequenzen in MuSK mit der AChR Aggregierung in Agrin-stimulierten Muskelzellen interferiert. Außerdem konnte im Modelsystem keine durch Agrin hervorgerufene und verstärkte Phosphorylierung von MuSK nachgewiesen werden. Diese schwerwiegenden Einschränkungen stellen die Funktionalität des neu entwickelten Modelsystems in Frage und machen zusätzliche Tests und Optimierung notwending.

The neuromuscular junction (NMJ) is the connection between an alpha motor neuron and a muscle fiber. This cholinergic synapse is formed during embryonic and early postnatal development and is characterized by the high postsynaptic enrichment of acetylcholine receptors (AChRs). Upon action potential arrival at the motor end plate, acetylcholine is released by the nerve and binds to AChRs at the muscle membrane, leading to subsequent contraction. NMJ derived diseases are summarized as myasthenic syndromes and symptoms range from muscle weakness to respiratory failure. Formation and maintenance of this highly specialized structure are based on signaling events, primarily initiated by the receptor tyrosine kinase ‘muscle-specific kinase’ (MuSK). Upon nerve innervation, pre-patterned AChR clusters are strengthened via secretion of nerve-derived agrin. Agrin binds to the postsynaptic located ‘low density lipoprotein receptor related protein 4’ (Lrp4), which in turn induces autophosphorylation of the MuSK kinase domain and subsequent AChR clustering. Furthermore, MuSK activation is thought to act as signal for endocytosis. As recent studies revealed sustained signaling events of other receptor tyrosine kinases in endosomal compartments, investigation of MuSK internalization and trafficking is of particular interest. At first, this master thesis was aimed on the development of a heterologous model system for agrin-Lrp4-MuSK signaling, because experimentation with differentiated muscle cells is complex. Affinity tagged MuSK and Lrp4 fusion proteins were generated via basic molecular biology cloning methods. Tags located in the extracellular portions of these proteins should allow specific protein detection in biochemical and immunocytochemistry analysis. Although protein tagging interfered with detection and expression levels, the biological functionality of fusion proteins was confirmed since they are able to rescue AChR clustering. Subsequently, mouse fibroblasts were modified via retroviral infection to stably express tagged MuSK and Lrp4 proteins. Promising cell populations were enriched via magnetic activated and fluorescence activated cell sorting. The second aim of this master thesis was to assess MuSK endocytosis in the newly developed model system. Endocytosis assays revealed a baseline MuSK internalization taking place within 5 minutes. MuSK was taken up into early endosomes and was predominantly trafficked to multivesicular bodies, while recycling only played a minor role. Lrp4 showed a similar baseline endocytosis but endocytosis was faster and recycling via Rab11 compartments was increased compared to MuSK. Binding of antibody or ligand to the respective affinity tag in MuSK was discovered to interfere with AChR clustering in agrin-stimulated myotubes. Furthermore, agrin stimulation of model system cells failed to clearly increased MuSK phosphorylation. Corresponding endocytosis assays did not reveal a major influence on MuSK internalization and trafficking upon agrin stimulation. These major limitations necessitate questioning of the functionality of the newly developed model system and demand further optimization.