Ziel des Projektes war, die Rolle der Kinase YES-1 im Hippo Signaltransduktionsweg in Leberkarzinomzelllinien zu charakterisieren. Die Hypothese beruhte auf der Annahme, dass YES-1 eine essentielle Rolle bei der Aktivierung der YAP/TEAD (Transkriptionsfaktoren des Hippo-Signaltransduktionsweges) abhängigen Expression im Leberkarzinom spielt. Um dies zu testen, wurde ein RNAi-vermittleter „Knockdown“ der Gene des Hippo Signalweges als auch von YES-1 selbst durchgeführt und der Effekt auf die Proliferation analysiert. Die Hälfte der behandelten Zelllinien zeigte Sensitivität gegenüber RNAi-vermittelter YES-1 Runterregulierung. Der anti-proliferative Effekt konnte durch Überexpression einer RNAi-resistenten Variante von wt-YES-1 aufgehoben werden. YES-1 wurde sowohl im Zytoplasma als auch im Nukleus detektiert, wobei zunächst kein Zusammenhang zwischen der sub-zellulären Lokalisation von Proteinen des Hippo Signalweges und der direkten Aktivierung durch YES-1 hergestellt werden konnte. Interessanterweise wiesen alle YES-1 überexprimierenden Zellen eine Hochregulierung von LATS1, einer zentralen Kinase im Hippo Signalweg, auf. Mit Hilfe von Ko-Immunpräzipitation wurde eindeutig eine Interaktion zwischen YES-1 einerseits und YAP und TEAD andererseits nachgewiesen. Mittels eines YAP/TEAD abhängigen Reportergensystems, das auf der Promotorsequenz des CTGF (“connective tissue growth factor“; Zielgen von YAP/TEAD) basierte, konnte die Aktivierung nach transienter YES-1 Expression bzw. Deaktivierung nach YES-1 „Knockdown“ beobachtet werden. Der Einsatz niedermolekularer Verbindungen wie Dasatinib (Inhibitor von YES-1) und Verteporfin (Inhibitor der YAP::TEAD Interaktion) als auch die Verwendung YAP::TEAD Interaktion inhibierender Peptide, zeigte erfolgreiche Deaktivierung des Reporters. Für diese Verbindungen wurden die EC50 Werte bestimmt. Die im Zuge der Arbeit generierten Daten lassen die Schlussfolgerung zu, dass YES-1 eine essentielle Rolle in der YAP/TEAD-abhängigen Aktivierung der Transkription spielt.

The project aimed at the elucidation of the contribution of the SRC-like kinase YES-1 to the tumorigenesis of hepatocellular carcinoma (HCC). The working hypothesis implied that YES-1 plays an essential role in the activation of the YAP/TEAD-driven expression. RNAi-mediated knockdown of genes of the Hippo pathway and YES-1 was correlated with sensitivity. Half of HCC lines tested were shown to be sensitive towards YES-1 knockdown including a rescue from the anti-proliferative effect by over-expression of RNAi-resistant wt-YES-1 but not by the kinase dead YES-1. The kinase was found to be located in the cytoplasm as well as in the nucleus. No prediction about dependency on YES-1 could be made based on the intracellular distribution pattern of YES-1 and other Hippo proteins. Interestingly, LATS1, a core kinase of the Hippo pathway, was found to be up-regulated in cells which were dependent on YES-1. An interaction between YES-1, YAP and TEADs could be demonstrated via co-immunoprecipitation. By using a YAP/TEAD dependent reporter gene assay based on the CTGF promoter (“connective tissue growth factor”; target gene of YAP/TEAD), activation of the reporter gene could be shown after transiently expressing YES-1 or deactivation after YES-1 knockdown, respectively. The application of small-molecule inhibitors like Dasatinib (inhibitor of YES-1) and Verteporfin (inhibitor of YAP::TEAD) as well as YAP::TEAD interaction inhibiting peptides exhibited an impaired reporter gene activity. IC50 values of these compounds were determined and correlated with genomic analyses. In conclusion, YES-1 kinase plays an essential role in YAP/TEAD-dependent activation of transcription.