Im globalen Stickstoffkreislauf ist chemolithotrophe Nitrifikation ein Schlüsselprozess, der ausschließlich von spezialisierten Mikroorganismen – nämlich von Ammoniak-oxidierenden Bakterien und Archeen sowie Nitrit-oxidierenden Bakterien – ausgeführt wird. Die Kultivierung und Kulturerhaltung von Ammoniak- und Nitritoxidierern sind äußerst schwierig, weshalb nur beschränktes Wissen über ihre Physiologie vorhanden ist. In dieser Studie wurden sowohl Anreicherungs- und Kultivierungstechniken als auch kultivierungsabhängige Methoden angewandt, um mehr Einblick in die Physiologie, Evolution und Nischendifferenzierung dieser wichtigen funktionellen Gruppe zu erhalten. Ein besonderes Augenmerk lag dabei auf Nitritoxidierern.

Zuerst wurde das Denitrifikationspotential einer Reinkultur des Nitritoxidierers Nitrospira moscoviensis weiter erforscht. N. moscoviensis-Biomasse wurde mit Nitrat (NO3 ) und verschiedenen Intermediaten und Vorstufen des Zitronensäure-Zyklus sowie mit verzweigten Aminosäuren, Ethanol oder Formiat inkubiert. Von den getesteten Substraten konnte N. moscoviensis lediglich Formiat und NO3 zur Energiegewinnung nutzen. Die Verwendung dieser Substrate könnte N. moscoviensis eine alternative Energiegewinnungsmöglichkeit in Abwesenheit von Sauerstoff als terminalem Elektronenakzeptor eröffnen. Zusätzlich könnte dieser Stoffwechselweg auch eine Symbiose zwischen aerob und anaerob lebenden N. moscoviensis-Populationen in der Umwelt ermöglichen.

Im zweiten Teil der Studie wurde eine Methode zur Untersuchung von möglichen Unterschieden auf Genom-Ebene und der sich daraus ergebenden funktionellen Differenzierung zwischen mikrodiversen koexistierenden Nitrifikanten in Belebtschlamm weiterentwickelt und in einer Vorstudie bewertet. Belebtschlamm wurde hierfür unter nitrifizierenden Bedingungen mit schweren Isotopen (13C und D2O) inkubiert, um aktive Mikroorganismen zu markieren. Danach wurden die Belebtschlammflocken durch Sonifizieren in Mikroflocken zerkleinert, wobei gezeigt werden konnte, dass diese Methode geeignet ist, einzelne Nitrifikanten-Kolonien in Mikroflocken zu erhalten. Danach wurden Raman-Spektren von Mikroflocken aufgenommen. Raman-Spektroskopie ermöglicht die Identifizierung aktiver Nitrifikanten, weil diese charakteristische Zytochrom-Signaturen aufweisen und der Einbau schwerer Isotope in Biomasse in den Spektren sichtbar ist. Es konnte gezeigt werden, dass D2O als Aktivitätsmarker gut geeignet ist, nicht jedoch 13C, da manche Nitrifikanten in ihren Raman-Spektren Peaks in der Region des 13C-Aktivitätsmarkers aufweisen. Ausgewählte Mikroflocken wurden mittels optischer Pinzette sortiert. Die so vereinzelten Mikroflocken wurden lysiert, ihre DNA mittels multiple displacement amplification (MDA) amplifiziert und MDA-Produkte durch PCR auf Anwesenheit von bakterieller und Nitrifikanten-DNA überprüft. Dadurch konnte gezeigt werden, dass gezieltes Sortieren von Nitrifikanten-Mikroflocken aufgrund ihres Raman-Spektrums im Vergleich zu zufälligem Sortieren nicht zu einer Anreicherung von Nitrifikanten-DNA in den erhaltenen MDA-Produkten führte. Nichtsdestotrotz enthielten MDA-Produkte von Mikroflocken mit Zytochrom-Signaturen signifikant häufiger Nitrifikanten-DNA als MDA-Produkte von Mikroflocken ohne Zytochrom-Signaturen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die eigentliche Selektion auf Nitrifikanten bereits durch das Zerkleinern von Belebtschlammflocken erfolgte, da Nitrifikanten als sehr robuste Mikrokolonien wachsen. Des Weiteren bedeutet dies, dass der Hauptvorteil der Raman-Spektroskopie darin liegt, aktive Mikroorganismen zu identifizieren. Aufgrund der PCR-Screening-Ergebnisse wurden 24 MDA-Produkte ausgewählt, um die Metagenome der sortierten Mikroflocken zu sequenzieren. Obwohl noch einige Schritte im Workflow optimiert werden könnten, ist die hier angewandte Methode für die Analyse von Genomen mikrodiverser Nitrifikanten aus Belebtschlamm sehr gut geeignet. Die in dieser Studie gewonnenen Erkenntnisse werden in Zukunft das Erstellen und Überprüfen von Hypothesen zur Nischendifferenzierung, Symbiose und Evolution von Koexistenz mikrodiverser Nitrifikanten in Belebtschlamm ermöglichen.

Im letzten Teil dieser Studie wurde eine neue Nitrotoga-Spezies aus Belebtschlamm angereichert, charakterisiert und höchstwahrscheinlich in Reinkultur erhalten. Diese neue Spezies wurde provisorisch Candidatus Nitrotoga fabula (fabula, lat. „kleine Bohne“, nach der charakteristischen Morphologie dieser Spezies) genannt. Diese neue Art gehört einer Untergruppe von Nitrotoga an, in der bisher keine beschriebenen Anreicherungen zu finden sind. Außerdem unterscheidet sie sich physiologisch deutlich von den zwei beschriebenen Anreicherungen, die beide bei niedrigen Temperaturen und Substratkonzentrationen angereichert wurden. Ca. N. fabula ist mit einem Temperaturoptimum von 28 °C und einer Substrattoleranz von etwa 15 mM NO2- die erste beschriebene mesophile Spezies in der Gattung Nitrotoga. Dies impliziert, dass die ökologische Nische der Gattung Nitrotoga viel breiter ist als zuvor angenommen. Zusätzlich wurde eine neue Art der Festmedium-Zubereitung angewandt, welche die Kultivierung von Ca. N. fabula auf Agarose-Platten ermöglichte. Diese Kultivierungsmethode wird in Zukunft die Forschung an diesen evolutiv höchst interessanten und kaum erforschten Nitritoxidierern erleichtern.

Zusammengefasst erweitern die Erkenntnisse, die in dieser Studie gewonnen wurden, das Wissen über mögliche Substrate von Nitrospira moscoviensis abseits von Nitritoxidation und die physiologischen Anpassungen der bisher kaum erforschten Gattung Nitrotoga. Außerdem wurde eine Methode zur Untersuchung von mikrodiversen koexistierenden Nitrifikanten in Belebtschlamm weiterentwickelt und beurteilt, die in Zukunft Erkenntnisse von unschätzbarem Wert bezüglich Nischendifferenzierung, Symbiose und Evolution dieser wichtigen Organismen ermöglichen wird.

Chemolithotrophic nitrification is a key process in the global nitrogen cycle, and is exclusively carried out by specialized microorganisms – namely ammonia oxidizing bacteria and archaea, and nitrite oxidizing bacteria. As these organisms are difficult to obtain and keep in axenic culture, only limited knowledge is available on their physiology. In the present study, both cultivation dependent and cultivation independent approaches were taken to gain further insight into physiology, evolution, and niche differentiation of these organisms, with the main focus on nitrite oxidizing bacteria.

First, the denitrification potential of an axenic culture of Nitrospira moscoviensis, a nitrite oxidizing bacterium, was assessed. Biomass was incubated under anoxic conditions in the presence of nitrate (NO3 ) and either tricarboxylic acid cycle precursors or intermediates, branched amino acids, ethanol or formate. It was shown that of the tested compounds, N. moscoviensis can only utilize formate and NO3 for energy generation under anoxic conditions. This may allow N. moscoviensis to gain energy during periods of anoxia, or even enable a syntrophy between aerobically and anaerobically growing N. moscoviensis populations in the environment.

Second, a method to obtain genomes of microdiverse coexisting nitrifiers from activated sludge was further developed and evaluated in a pre-study to gain insights into mechanisms allowing for coexistence and niche differentiation. Activated sludge was incubated under nitrifying conditions in the presence of heavy isotopes (13C or D2O) to allow for detection of active microorganisms. Incubated sludge was dissected by sonication, and it was shown by FISH that this method is suitable for obtaining single nitrifier microcolonies within microflocs. Subsequently, Raman spectra were acquired for the obtained microflocs. Raman spectra allowed for detecting active nitrifiers based on the presence of cytochrome signatures, which are indicative of nitrifiers, and presence of activity marker signatures. It was shown that incubation is feasible with D2O, but not with 13C as activity marker, as some nitrifiers possessed inherent peaks in the 13C marker region. Obtained microflocs were sorted by optical tweezing. Cells of sorted microflocs were lysed, their DNA amplified by multiple displacement amplification (MDA), and MDA products were screened by PCR for bacterial and nitrifier DNA. It was shown that targeted sorting of active nitrifiers did not significantly enrich for nitrifiers in comparison to random sorting. Nonetheless, microflocs whose Raman spectra contained cytochrome signatures significantly more often contained nitrifier DNA than those without. These observations imply that the main enrichment for nitrifiers already occurred during sonication, as nitrifiers grow in very rigid microcolonies, which are resistant to dissection. This also implies that the main advantage of using Raman spectroscopy is to identify active microorganisms. Lastly, 24 MDA products were selected for microfloc metagenome sequencing. While some steps in the workflow can still be optimized, overall the employed strategy seems well suited to obtain (at least partial) genomes from nitrifiers in activated sludge, which will allow for the generation of hypotheses regarding niche differentiation, symbiosis and evolution of coexistence among microdiverse nitrifiers.

Finally, a novel species of the genus Nitrotoga, tentatively named Candidatus Nitrotoga fabula (fabula, lat. “small bean”, named after the characteristic morphology of this species), was enriched from activated sludge from WWTP Klosterneuburg, characterized, and likely obtained in axenic culture. This novel species belongs to a sublineage of Nitrotoga without described relatives and shows drastically different physiology when compared to the two previously described enrichments, which were obtained at low substrate concentrations and temperatures. Ca. N. fabula is the first described mesophilic species of the genus, with a NO2- tolerance of approximately 15 mM and a temperature optimum of 28 °C, indicating that the environmental niche of Nitrotoga is likely much wider than previously assumed. Additionally, a novel solid medium preparation was employed, which allowed cultivation of Ca. N. fabula on plates and will simplify further research on this evolutionarily highly interesting and hardly investigated nitrite oxidizers.

Taken together, the insights gained in this study have expanded the knowledge on nitrifying bacteria regarding substrate utilization of N. moscoviensis and physiological adaptations within the hardly investigated genus Nitrotoga. Additionally, the further development and evaluation of the workflow for studying microdiverse coexisting nitrifiers is expected to yield invaluable information on niche differentiation, symbiosis and evolution of these important organisms.