Studies on the mode of action of KP46 – a gallium-containing investigational anticancer drug

Cornelia Wittmann

doi:10.25365/thesis.37882

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Title (eng)

Studies on the mode of action of KP46 – a gallium-containing investigational anticancer drug

Author

Cornelia Wittmann

Advisor

Bernhard Keppler

Assessor

Bernhard Keppler

Abstract (deu)

Bald nachdem Gallium erfolgreich für Diagnosezwecke eingesetzt wurde, konnte auch eine Aktivität gegen Krebs nachgewiesen werden. Da Galliumsalze bei oraler Einnahme nur bedingt bioverfügbar sind, wurde KP46, Tris(quinolinolato)gallium(III), entwickelt. Dieser lipophile Galliumkomplex zeigte in einer klinischen Phase I-Studie vielversprechende Ergebnisse, insbesondere bei Nierenkrebs. In dieser Arbeit wurden Aspekte des Wirkmechanismus‘ dieser Galliumverbindung in der humanen Darmkrebszelllinie HCT-116 Wildtyp untersucht. Um die Hypothese zu überprüfen, dass KP46 den Zelltod p53-abhängig hervorruft, wurden auch die Sublinien HCT-116 p53 Knockout und HCT-116 bax Knockout verwendet. Der Tumorsupressor p53 reguliert die Apoptose und damit auch Downstream-Proteine des intrinsischen Apoptosewegs, wie z.B.: bax. Abgesehen von der Zytotoxizität sollte die Rolle der Autophagie, der unfolded protein response (UPR) und der intrazellulären Eisenpools in der Reaktion auf KP46-Behandlung ermittelt werden. Galliumnitrat diente hier als Referenzsubstanz, um die Resultate eines Galliumsalzes mit jenen des oral verfügbaren Galliumkomplexes zu vergleichen. Die Zytotoxizität von KP46 und Galliumnitrat wurde mittels des kolorimetrischen MTT-Assays untersucht. Für KP46 wurde eine halbe maximale inhibitorische Konzentration im niedrigen mikromolaren Bereich bestimmt. Keine Unterschiede wurden jedoch zwischen den drei unterschiedlichen Zelllinien beobachtet. Wie erwartet zeigte Galliumnitrat eine niedrigere Aktivität gegen Krebszellen. Die Aktivierung der UPR in Folge von ER-Stress wurde mit Hilfe von Western Blotting und qPCR untersucht. Nach der Behandlung mit KP46 und Galliumnitrat konnten keine signifikanten Änderungen der Expression von UPR-Schlüsselproteinen (PERK, Grp78 & PeIF2α) und mRNA-Levels (CHOP, Grp78 & XBP1 splicing) nachgewiesen werden. Beide Galliumverbindungen modifizieren das LC3B-Protein und induzieren somit Autophagie. Da Gallium gewisse chemische Eigenschaften mit Eisen teilt, ist ein Einfluss auf die zellulären Eisenpools wahrscheinlich. Für die Messung des intrazellulären labilen Eisenpools wurde ein auf Calcein basierender Test in HCT-116 Wildtyp-Zellen angewendet. Nach 6 Stunden KP46-Behandlung war die labile Eisenkonzentration im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle um fast 50% erhöht. Eine direkte Wechselwirkung von KP46 mit dem Fluorophor Calcein wurde mit Hilfe eines zellfreien Calcein-Experiments ausgeschlossen. Des Weiteren wurde in HCT-116 Wildtyp-Zellen nach 6 h KP46-Behandlung ein Anstieg, jedoch nach 24 h ein Abfall des Eisenspeicher-Proteins Ferritin nachgewiesen. Im Vergleich dazu hatte Galliumnitrat einen geringeren Effekt auf den labilen Eisenpool und erhöhte die Ferritin-Konzentration auch nach 24 h. Diese Ergebnisse deuten auf einen unterschiedlichen Wirkmechanismus der beiden Galliumsubstanzen hin. In keiner der drei Zelllinien konnte eine Bildung reaktiver Sauerstoff-Spezies durch KP46 nachgewiesen werden.

Abstract (eng)

Soon after gallium was successfully established as a diagnostic imaging agent, the metal ion was proven to show anticancer activity. Since the oral applicability of gallium salts is limited by low bioavailability, KP46 (tris(8-quinolinolato)gallium(III)), a gallium coordination compound, was investigated. This lipophilic gallium complex showed promising results in a phase I clinical trial, especially regarding the treatment of renal cancer. In this thesis aspects of the mechanism of action of this gallium compound were examined in the human colon carcinoma cell line HCT-116 wild type. In order to examine the hypothesis that KP46 treatment induces cell death in a p53-dependent manner, the sublines HCT-116 p53 knockout and HCT-116 bax knockout were used additionally. The tumor suppressor p53 is known to regulate apoptosis and thereby downstream proteins of the intrinsic apoptotic pathway, such as bax. Apart from cytotoxicity, the role of autophagy, the unfolded protein response and intracellular iron pools in response to KP46 treatment were investigated. Gallium(III) nitrate (Ga(NO3)3) served as a reference substance for comparing the results of a gallium salt with the orally available gallium complex. The cytotoxicity of KP46 and Ga(NO3)3 was examined by the colorimetric MTT assay. A half maximal inhibitory concentration in the low micromolar range was determined for KP46. As expected Ga(NO3)3 showed lower antiproliferative activity. No differences between the investigated cell lines were observed for both gallium compounds. The induction of the unfolded protein response (UPR) and endoplasmic reticulum (ER) stress was examined by Western blotting and qPCR. KP46 and Ga(NO3)3 treatment caused no significant alterations of UPR-related key protein levels (PERK, Grp78 & PeIF2α) and mRNA levels (CHOP, Grp78 & XBP1 splicing). Both gallium compounds were found to modify the LC3B protein and indicating the induction of autophagy. Since gallium shares certain properties with iron, an influence of the intracellular iron pools seems likely. For the measurement of the intracellular labile iron pool a calcein-based assay was employed in HCT-116 wild type cells. After 6 hours of KP46 treatment, the labile iron concentration had increased by almost 50% relative to the untreated control. A direct interaction of KP46 with the fluorophore calcein was excluded by a cell-free control experiment. Furthermore, KP46 increased the amount of the iron storage protein ferritin in HCT-116 wild type cells after 6 hours but led to a decrease after 24 hours. In contrast Ga(NO3)3 had a minor effect on the labile iron pool and enhanced the ferritin concentration even after 24 hours. These results indicate a different mechanism for these two gallium compounds. There was no evidence found for the generation of reactive oxygen species by KP46 in any of the three cell lines.

Keywords (eng)

KP46ER stressautophagylabile iron pool

Keywords (deu)

KP46ER-StressAutophagieLabiler Eisenpool

Subject (deu)

Anorganische Chemie: Sonstiges

Subject (deu)

Molekularbiologie

Subject (deu)

Biochemie: Allgemeines

Type (deu)

Masterarbeit