Zusammenfassung Die Grünalge Spirogyra (Streptophyta, Zygnemataceae) ist aufgrund ihrer typischen vegetativen Morphologie leicht identifizierbar. Sie wird charakterisiert durch unverzweigte Filamente und Zellen mit ein bis mehreren spiralig gewundenen Chloroplasten (Kadlubowska 1984; Kolkwitz & Krieger 1941; McCourt et al. 1986; Randhawa 1959a; Transeau 1951). Die einfache Struktur wird oft fälschlicherweise als Hinweis für eine niedrige genetische Diversität gedeutet. Spirogyra wird meist von phylogenetischen Analysen ausgeschlossen; unter anderem auch, weil Spirogyra lange Äste in Phylogenien verursacht („long branch taxon“), was durch eine hohe Evolutionsrate hervorgerufen wird. Weiters wird sie wegen der problematischen Artbestimmung von vielen ökologischen Analysen ausgenommen, obwohl die ökologische Nische der Gattung eine große Bandbreite von Süßwasser- bis Brackwasserstandorten abdeckt (Hoshaw & McCourt 1988; Rieth 1983; Simons & Van Beem 1990) und von naturbelassenen Bergseen und Moorstandorten bis hin zu hoch eutrophen Standorten vorkommt (Hainz et al. 2009). Die Artbestimmung in dieser Gattung ist schwierig, da nicht nur der komplette Reproduktionszyklus (Konjugation), sondern auch reife Zygosporen (Hypnozygoten) vorhanden sein müssen (Kadlubowska 1984; Kolkwitz & Krieger 1941; McCourt et al. 1986; Randhawa 1959a; Transeau 1951). Studien zur genetischen Diversität sind rar. Untersuchungen zur Stellung von Spirogyra innerhalb der Zygnematophycea leiden unter dem geringen Stichprobenumfang; der Stammbaum ist zwar viel diskutiert, aber immer noch unklar – besonders im Bezug auf die Beziehung auf die Gattung Sirogonium. Um diese Frage zu beantworten und um einen bessern Einblick in die genetische Diversität der Gattung Spirogyra zu bekommen, haben wir folgende Untersuchungen durchgeführt. Die verwendeten Algenproben wurden an 133 verschiedenen Standorten im Zeitraum von März 2006 bis Oktober 2007 gesammelt und kultiviert (Hainz et al. 2009). Ein Teil davon wurde für die genetischen Untersuchung in den folgenden Manuskripten verwendet. Die phlyogenetischen Untersuchungen der SSU rRNA Sequenzen von 130 Spirogyra Kulturen zeigte Untertteilung in acht Kladen. Im ersten Teil unserer Studien entdeckten wir in etwa 60% der Sequenzen (Kladen A-D) ein 1506 Gruppe I Intron, die Sequenzen ohne Intron (Kladen E-H) bildeten zusammen eine monophyletische Gruppe, die an einem langen Ast plaziert wurde. Das in Spirogyra gefundene Intron gehört zu den IC Gruppe I Introns. Es liegt an derselben Stelle wie das Intron, das bei Zygnematalen gefunden wird und weist weitere Charakteristika dieses Typuses auf (typische Domänenstruktur (P1-P9), Basenkomposition, stark konservierte Regionen, die GU Paarung (auf 5‘ Seite) und das G (auf 3‘ Seite), die der Spleiß-Stelle vorangehen. Es weist sowohl Merkmale von frühen (optionale P2 Domäne) als auch von sich später abzweigenden (Variation der typsichen L5b GAAA vierfach Schleife) Desmidiaceae auf. Phylogenetische Analysen des Gruppe I Introns von Spirogyra zeigten einen monophyletischen Ursprung der Gattung innerhalb der Zygnematophyceae. Die Analysen zeigten weiters, daß die Mutationsrate für die SSU rRNA höher war als für das Intron selbst. Daraus schliessen wir auf einen sekundären Verlust des Introns in den Kladen E-H, der durch die hohe Mutationsrate und die lange Entwicklung verursacht wurde. Im zweiten Teil unserer Untersuchungen lag der Fokus auf den phylogenetischen Beziehungen innerhalb Spirogyras und auch zu anderen Zygnematophyceen. 130 Spirogyra SSU rRNA Sequenzen wurden mit Hilfe komplexer Evolutionsmodelle analysiert (posterior probability, maximum likelihood, neighbor joining und maximum parsimony methods). Das Resultat waren acht Kladen innerhalb Spirogyras, die die Gattung Sirogonium einschlossen. Die phylogenetische Beziehung zur Gattung Spirotaenia wurde nicht ausreichend geklärt. Die Untersuchungen zeigten, dass die 130 Sequenzen 53 Klone im Bezug auf die SSU rRNA beinhalten. Keiner dieser Klone hatte eine niedrigere Mutationsrate oder konnte an einem kürzeren Ast als die restliche Gattung plaziert werden. Weiters wurde die Monophyllie der Gattung bestätigt. Die genetischen Unterschiede innerhalb der Gattung Spirogyra waren größer als die innerhalb der anderen analysierten Gattungen der Zygnemataceae. Es wurde eine große Anzahl an sog. nicht-homoplasischen Synapomorphien (NHS; 114 NHS gesamt) gefunden, 41 NHS für Spirogyra und 73 NHS für die einzelnen Kladen. Dies betont die hohe genetische Diversität der Gattung und die Distanz zu den anderen Zygnematophyceae. In einem dritten Schritt haben wir das Problem der Artkonzepte, Artdefinition und –zahl in der Gattung Spirogyra beleuchtet. Wir haben ITS2 Sekundärstrukturen und den entsprechenden Barcode miteinbezogen. Das konventionelle Artkonzept der fädigen Grünalge Spirogyra basiert nur auf morphologischen Merkmalen, was die phylogenetischen Beziehungen nicht wiederspiegelt. Der ITS2 Barcode wurde zur Schätzung der Artzahl unseres Datensets verwendet. Sequenzen, die sich um mindestens einen kompensatorischen Basenaustausch unterschieden, wurden als unterschiedliche Arten definiert. 51 verschiedene Arten wurden mit Hilfe von Barcoding voneinander unterschieden. Von den 120 verwendeten Sequenzen wurden 68 durch nur eine Seuqenz repräsentiert, 23 durch mehrere. Die ITS2 Sekundärstruktur wurde analysiert, aber wegen der großen Unterschiede in der Primär- und Sekundärstruktur wurde keine Konsensusstruktur gefunden. Sie zeigt trotzdem die typischen Merkmale der ITS2 Sekundärstruktur. Die üblicherweise stark konservierte Region am 5’ Ende von Helix III zeigt in der Gattung Spirogyra einige Abwandlungen, ist aber gut identifizierbar. Einige der Sequenzen haben eine Helix IV, einige sogar einen zusätzlichen Arm an Helix III. Vegetative Morphologie, Zugehörigkeit zu Kladen und Klonen wurden auf Muster und Korrelationen hin untersucht. Es wurden einige Korrelationen gefunden, diese waren allerdings nicht signifikant genug, um Aussagen zu unterstützen, welche Morphologie bestimmten Kladen zugeordnet werden könnten und umgekehrt. Innerhalb einiger Klone wurde außerdem eine variable Morphologie beobachtet. Mit unseren Studien haben wir versucht etwas Licht auf die phylogenetisch vernachlässigte Gattung Spirogyra und ihre große genetische Diversität zu werfen, die unserer Meinung nach bisher stark unterschätzt wurde. Unser Datenset deckt eine große Vielfalt an verschiedenen vegetativen Morphologien ab, die von Standorten sehr verschiedenen Typs gesammelt wurden. Wir haben bewiesen, dass vegetative Morphologie ein schlechter Indikator für genetische Diversität ist. Unsere Studien haben die außergewöhnliche Stellung der Gattung Spirogyra innerhalb der Zygnematopyceae und den Einschluss der Gattung Sirogonium bestätigt. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine hohe Evolutionsrate, ein abweichendes Muster in der Basen-Substituion und eine relativ rezente Ausbreitung Grund für die Platzierung an langen Ästen bei Phylogenien sein könnte, obwohl Spirogyra eine sich früh von den übrigen Zygnematophyten wegentwickelten Gattung ist.

Abstract The green alga Spirogyra (Streptophyta, Zygnemataceae) is easily recognizable based on its vegetative morphology, which is characterized by unbranched filaments and cells that have one to several coiled chloroplasts (Kadlubowska 1984; Kolkwitz & Krieger 1941; McCourt et al. 1986; Randhawa 1959a; Transeau 1951). This simple structure falsely points to a low genetic diversity: Spirogyra is commonly excluded from phylogenetic analyses; also because the genus is known as a long-branch taxon caused by a high evolutionary rate. It is excluded from many ecological analyses because of difficulties in species determination, although its ecological niche covers a wide range from fresh to slightly brackish water bodies (Hoshaw & McCourt 1988; Rieth 1983; Simons & Van Beem 1990) and from dystrophic mountain lakes and bogs to highly eutrophicated systems (Hainz et al. 2009). Traditional species determination is problematic, because it requires the complete reproductive (conjugation) cycle including zygospores (hypnozygotes) (Kadlubowska 1984; Kolkwitz & Krieger 1941; McCourt et al. 1986; Randhawa 1959a; Transeau 1951) is necessary. Studies elucidating genetic diversity are rare, whereas studies on the position of Spirogyra among the other Zygnematophyceaen genera often suffer from limited taxon sampling; the relation to these genera is much discussed but unclear – especially the relation to the genus Sirogonium. To resolve these questions and get a better impression of the genetic diversity of the genus Spirogyra, we conducted the following studies. Algal samples used for the following studies were collected at 133 sites from March 2006 to October 2007 (Hainz et al. 2009) and cultivated. A selected subsample/part of them was extracted and analyzed as described in the manuscripts. Phylogenetic analyses of SSU rDNA sequences of 130 Spirogyra strains revealed that these strains are subdivided into eight clades. In the first part of our studies, we discovered that approximately 60% of the assessed strains (clades A–D) contain a 1506 group I intron, whereas strains without introns form individual clades that cluster together in a long branch (E–H). The Spirogyra intron belongs to the IC group I introns and shares the common insertion site of the Zygnematalean intron and many common features (the typical domain structure (P1–P9), the base composition, the highly conserved regions, the GU pair preceding the 5’ splice site and the G preceding the 3’ splice site). It exhibits features of early desmids (optional P2 domain) as well as of later diverging desmids (variation of the typical L5b–GAAA tetraloop). Phylogenetic analyses of the Spirogyra group I intron showed the monophyletic origin of the genus within the Zygnematophyceae; analyses also showed a higher mutation rate in the SSU rRNA than in the intron. Therefore, we assume the secondary loss of the intron in clades E–H is caused by the high evolutionary rate of Spirogyra and its long evolutionary history. The second part focused on the genetic diversity within Spirogyra and its phylogenetic relation to other Zygnematophyceaen taxa. The 130 Spirogyra SSU rDNA sequences used for phylogenetic analyses were tested using complex evolutionary models (posterior probability, maximum likelihood, neighbor joining and maximum parsimony methods). We found that the eight resulting clades formed by Spirogyra include the genus Sirogonium, but the phylogenetic relationship to the genus Spirotaenia was not resolved satisfactorily. Even though sequence comparisons revealed 53 individual clones, our results still support monophyly of the genus. Our data set did not contain a single slow-evolving taxon that would have been assigned to a shorter branch compared to the remaining sequences. The genetic distance within the genus Spirogyra exceeds the distances measured within any other genus of the remaining Zygnemataceae included in this study. A large number of non-homoplasious synapomorphies (NHS; 114 NHS in total) was found for Spirogyra (41 NHS) and for each clade (totaling 73 NHS). This emphasizes the high genetic diversity of this genus and the distance to the remaining Zygnematophyceae. In a third step, we addressed the issue of species definition and number in the genus Spirogyra. We included ITS2 secondary structure information as well as ITS2 barcode. The traditional species concept of the filamentous alga Spirogyra is based on morphological traits and does not reflect phylogenetic relationships. The ITS2 barcode was used to estimate the species number of our data set; sequences that differed by at least one compensatory base change were considered putative different species. Out of 120 sequences, 68 were found only once and 23 were found more than once; 51 putative species were separated by ITS2 barcoding. The ITS2 secondary structure was analyzed, but no consensus structure could be found due to the big variation in primary and secondary sequences. The overall structure shows the typical features of ITS2 secondary structure. The typically conserved region at the 5’ end of helix III is less conserved in this genus, but still recognizable. Some strains exhibit a helix IV, some an extra arm in helix III. The correlation of vegetative morphology, clade grouping and information on clone grouping was analyzed statistically to find patterns. Correlations were found, but were too weak to support projections which morphology would belong to a certain clade and vice-versa. Also within single clones, some variation in morphology was found. Our studies tried to shed light on a phylogenetically neglected genus with great genetic diversity that has been underestimated to this day. Our data set included samples from a large variety of water bodies and many different vegetative morphotypes. We proved that vegetative morphology is a poor indicator for genetic diversity. Our studies confirmed the exceptional position of the genus Spirogyra among the Zygnematophyceaen taxa and the inclusion of the genus Sirogonium. Our findings indicate that a high evolutionary rate, a different pattern in base substitution and recent radiation might be the reasons for the long-branch status of Spirogyra, despite it being an early diverging genus within the Zygnematophytes. Hainz, R., C. Wöber, et al. (2009). "The relationship between Spirogyra (Zygnematophyceae, Streptophyta) filament type groups and environmental conditions in Central Europe." Aquatic Botany 91(3): 173-180. Hoshaw, R. W. and R. M. McCourt (1988). "The Zygnemataceae (Chlorophyta): A twenty-year update of research." Phycologia 27(4): 511-548. Kadlubowska, J. Z. (1984). Conjugatophyceae I - Zygnemales. Süßwasserflora von Mitteleuropa, Chlorophyta VIII. H. Ettl, H. Gerloff, H. Heynig and D. Mollenhauer, Stuttgart, New York: Gustav Fischer Verlag. Kolkwitz, R. and H. Krieger (1941). Zygnemales. Dr. L Rabenhorst's Kryptogamen-Flora von Deutschland und der Schweiz. R. Kolkwitz, Akademische Verlagsgesellschaft Becker & Erler, Leipzig. XIII, 2 Abteilung: 499 pp. McCourt, R. M., R. W. Hoshaw, et al. (1986). "Distribution, morphological diversity and evidence for polyploidy in North American Zygnemataceae (Chlorophyta)." Journal Of Phycology 22(3): 307-315. Randhawa, M. S. (1959). Zygnemaceae. New Delhi, Indian Council of Agricultural Research. Rieth, A. (1983). "Eine Spirogyra von der Ostsee bei Zingst." Genetic Resources and Crop Evolution 31(2): 317-326. Simons, J. and A. Van Beem (1990). "Spirogyra species and accompanying algae from pools and ditches in The Netherlands." Aquatic Botany 37(3): 247-269. Transeau, E. N. (1951). The Zygnemataceae (Fresh-water conjugate algae), The Ohio State University Press.