Probing of non-oncogene addiction targets in leukemia using advanced shRNAmir technology

Thomas Hoffmann

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Title (eng)

Parallel title (deu)

Sondierung von Onkogen unabhaengingen Schwachstellen in Leukämie mit Hilfe modernster shRNAmir Technologie

Author

Thomas Hoffmann

Advisor

Johannes Zuber

Assessor

Veronika Sexl

Robert Eferl

Abstract (deu)

Akute myeloische Leukämie (AML) ist die häufigste Form der Leukämie und verantwortlich für 43% aller Leukämiefälle. Sie entsteht durch das Zusammenspiel von heterogenen und dynamischen Mutationen von denen die meisten nicht gezielt inhibiert werden können. Trotz der großen Vielfalt an Mutationen werden davon nur einige wenige zelluläre Prozesse beeinflusst, was zur Entstehung von Leukämie spezifischen Abhängigkeiten führt die für eine klinische Intervention ausgenützt werden können. Vor allem im Bereich der Regulation des Chromatinstatus einer Zelle und bei der Regulation des Zellzyklus haben Strategien die diese Oncogen unabhängigen Schwachstellen von Krebszellen ausnützen schon vielversprechende Resultate in der klinischen Forschung gezeigt. Um die Entwicklung neuer Therapieansätze zu beschleunigen haben wir eine Sammlung von shRNAs gegen 1133 Gene zusammengestellt für die es entweder schon Inhibitoren gibt, die potentiell inhibierbar sind oder die in humanen Leukämien mit MLL Fusionsprotein dereguliert sind. Mittels einem gebündelten RNA Interferenz Screen in einem MLL-AF9;NrasG12D-AML Mausmodell und in immortalisierten Fibroblasten haben wir mehrere Gene identifiziert deren Inhibierung Leukämie spezifische Effekte zeigt. Interessanterweise sind unter den Top 10 Genen 5, die in grundlegende metabolische Prozesse in der Zelle involviert sind. Sowohl im primären Screen, als auch bei der sekundären Validierung von top Genen in murinen und humanen Kontexten zeigt sich Gart, ein trifunktionales Enzym in der de novo Purinsynthese, als markanteste Schwachstelle. Parallele Vergleiche zu etablierten Genen wie BRD4, PLK1 und anderen metabolischen Genen zeigen, dass der Leukämie spezifische Effekt von Gart deutlich stärker ist als bei allen anderen bisher untersuchten Genen. Interessanterweise können Inhibitoren die die GARTfase Aktivität von Gart inhibieren, diese Effekte nicht reproduzieren. Zusammen mit Erkenntnissen aus Experimenten mit mutierten Gart-cDNAs deutet alles drauf hin, dass die AIRS Aktivität für neue AML Therapieansätze in Betracht gezogen werden sollte. Des weiteren liegt GART auf Chromosom 21, in einer Region die in pädiatrischen Leukämien oft amplifiziert ist, was bedeuten könnte, dass Gart auch zur Leukämieentstehung beträgt. Die Analyse von publizierten Expressionsdaten zeigt, dass Gart im Gegensatz zu normalem Gewebe oft überexprimiert ist, besonders in hämatopoetischen Tumoren. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Inhibition von Gart einen vielversprechenden neuen Therapieansatz darstellt, der drauf beruht den erhöhten Bedarf an Nukleotidbausteinen in Krebszellen auszunützen.

Abstract (eng)

Acute myeloid leukemia (AML), the most common leukemia subtype accounting for 43% of leuke-mia deaths, arises from heterogeneous and dynamic patterns of driver mutations, most of which remain undruggable. Despite their diversity, individual mutations converge to dysregulate a lim-ited number of cellular processes, which is thought to result in leukemia-specific dependencies. Strategies aimed at exploiting “non-oncogene addiction” to chromatin and cell-cycle regulators have recently shown promise in a wide range of AML subtypes. To accelerate the search for rapidly translatable non-oncogene addiction targets, we have constructed a custom shRNA library target-ing 1133 candidate genes including known targets of established small-molecule inhibitors and tool compounds as well as potentially druggable genes that were found overexpressed in high-risk MLL-rearranged AML. Using multiplexed screens in an MLL-AF9;NrasG12D-driven AML mouse model and murine embryonic fibroblasts, we identify and validate a set of non-essential genes whose suppression triggers dramatic anti-leukemic effects. Strikingly, among the ten most potent leukemia-specific sensitivities, we identify five genes involved in diverse metabolic processes. Both in the primary screen and secondary validation studies in murine and human AML contexts, shRNA-mediated suppression of GART, a tri-functional enzyme in de novo purine synthesis, turned out to be the most prominent leukemia-specific vulnerability. Remarkably, side-by-side compari-sons to previously proposed and established targets (including BRD4, PLK1 and various metabolic targets), reveal that the potency and leukemia-specificity of these effects are unmatched. Inter-estingly, available antifolate inhibitors of GARTfase (catalyzing the second GART-dependent enzy-matic step), do not phenocopy the effects of shRNA-mediated GART suppression. In addition, sev-eral cDNA rescue experiments with mutated versions of Gart suggests that the GARTfase activity does not represent the key bottleneck in AML and the AIRS activity should be targeted for a po-tential new therapy. Importantly, GART is located on chr21 in a region commonly amplified in pediatric B-ALL, suggesting that GART may have driver functions in iAMP21+ and Down syndrome-associated leukemia. Furthermore, reanalysis of expression profiling studies reveal that GART is one of the most commonly overexpressed genes in a wide variety of hematopoietic and other malignancies. In summary, our study identifies inhibition of GART as promising strategy to thera-peutically exploit the increased demand for nucleotide building blocks, which has been proposed as a hallmark of cancer cell metabolism.

Keywords (eng)

leukemiaRNAiAMLpurin synthesisGart

Keywords (deu)

LeukämieRNAiAMLPurinsyntheseGart

Subject (deu)

Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines

Subject (deu)

Molekularbiologie

Subject (deu)

Genetik

Type (deu)

Dissertation