Title (eng)
Characterizing Wnt proteins and cytoskeletal effectors during MuSK signaling
Author
Sandra Parzer
Advisor
Ruth Herbst
Assessor
Ruth Herbst
Abstract (deu)
Zusammenfassung
Die neuromuskuläre Synapse ist die spezialisierte Verbindung zwischen einer Muskelfaser und einem Motorneuron. Diese Synapse reguliert jegliche Art der Bewegung, inklusive der Atmung, innerhalb eines Organismus. Ein wichtiger Faktor für die erfolgreiche Synapsenbildung ist die Aktivierung der muskelspezifischen Rezeptor-Tyrosinkinase (MuSK) und die daraus folgenden Signalkaskaden bis zum Clustering von Acetylcholinrezeptoren (AChR). Die korrekte Synapsenbildung während der Embryonalentwicklung und frühen postnatalen Entwicklung ist lebensnotwendig für einen Organismus. Die postsynaptische Seite charakterisiert sich durch hochkonzentrierte AChR in „Pretzelform“, welche der präsynaptischen, aktiven Zone mit akkumulierten Acetylcholinvesikeln an der Nervenendigung gegenüber steht. Der muskelinnervierende Motornerv initiiert die Freisetzung von Agrin, einem Proteoglycan, welches zur Aktivierung von MuSK und Lrp4 führt. Die Bildung und Stabilisierung der neuromuskulären Synapse erfordert das genaue Zusammenspiel aller beteiligten molekularen Faktoren. In den letzten Jahren wurde erkannt, dass MuSK auch durch Wnt Proteine aktiviert werden kann und dass Wnt Proteine eine Rolle beim Nerv-unabhängigen Clustering von AChR spielen. Wnt Proteine erkennen und binden die cysteinreiche Domäne von MuSK, welche deren nativen Rezeptor Frizzled ähnelt, führen zu MuSK Phosphorylierung und AChR Anhäufung. Die Rolle von Wnt Proteinen und weiteren synapsenbildenden Hilfsproteinen während der AChR Clusterbildung soll in dieser Masterarbeit untersucht werden.
Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit Proteinen, die das Zytoskelett remodellieren und somit zum Proteintransport und zum Aufbau der AChR Cluster beitragen. Dynamin-2, FAK, Lrp4 und EB3 wurden mit Hilfe von RNAi herunterreguliert und dessen Auswirkung auf AChR Clusterbildung untersucht. Ziel war es, Muskelzelllinien zu etablieren, welche ein Tet-ON Expressionssystem stabil exprimieren. Somit kann die shRNA Expression mit Doxycyclinzugabe präzise gesteuert werden. In vier Proteinen konnte eine erfolgreiche Herunterregulierung in den jeweiligen Zelllinien erziehlt werden. Dynamin2, EB3 und FAK wiesen eine signifikante Knockdownrate von ca. 50% auf, Lrp4 eine Runterregulierung von etwa 40%. Allerdings zeigte nur Lrp4 knockdown eine Reduktion von AChR Clustern, bei FAK knockdown war die AChR Clusterbildung nicht beeinflusst.
Der Zweite Teil konzentrierte sich auf die Agrin-unabhängige MuSK Aktivierung durch Wnts. Wnt Proteine wurden in heterologen Zellen (CHO, Chinese Hamster Ovary cells) exprimiert und aus dem Überstand aufgereinigt. Der Fokus wurde auf die Erstellung von Wnt 4, 9a und 11 stabil exprimierenden CHO Zelllinien und die Optimierung der Proteinisolierung gelegt. Außerdem wurde die spezifische Bindung der Wnt Proteine an MuSK und deren Lokalisation in der Zelle untersucht. Wnt Proteine konnten erfolgreich angereichert werden, jedoch in zu geringer Konzentration um sie für weiterführende Versuche an C2C12 Zellen verwenden zu können. Weiters konnte die spezifische Bindung von Wnt4 an MuSK durch Ko-Immunopräzipitation gezeigt werden und Ko-lokalisation der drei interagierenden Proteine Wnt, MuSK und Lrp4 an der Zelloberfläche nachgewiesen werden.
Abstract (eng)
Abstract
The neuromuscular junction is the connection between muscle and the innervating motoneuron. Its highly specialized structure is important for muscle movement, including breathing and thus the non- or malfunction leads to severe diseases or even death. The innervating motoneuron approaches the muscle guided by the prepatterned AChR cluster region, stabilizes the clusters and leads to their ‘Pretzel’-shaped form. The presynaptic motoneuron accumulates vesicles carrying the neurotransmitter acetylcholine at the active zone, opposite of the muscle’s postsynaptic density region, where AChRs become concentrated. The motoneuron releases agrin, a proteoglycan, which diffuses through the synaptic cleft, binds to Lrp4 and leads to homodimerization of MuSK and its activation. Subsequent signaling events lead to phosphorylation of AChR-β subunit and the stabilization of AChR cluster and NMJ maturation. More recently, Wnt proteins have been implicated in MuSK activation and nerve-inpendent AChR clustering, termed prepatterning. In this thesis the role of Wnt proteins and specific cytoskeletal effectors was studied.
The focus of the first project in this thesis was set on the creation of a model system for doxycycline-induced downregulation of MuSK target proteins involved in MuSK activation, internalization, AChR clustering and cytoskeletal rearrangements. Therefore, the method of RNAi or RNA-induced silencing was applied for controlled downregulation of Dynamin-2, Lrp4, EB3 and FAK. The aim was to test target protein downregulation, differentiation of myotubes and the effect on AChR clustering in doxycycline-treated and untreated C2 myotubes. Results indicated successful downregulation of endogenous Dynamin-2, FAK and EB3 by more than 50%. Lrp4 showed a downregulation rate of approximately 40%. A reduced number of AChR clusters in response to agrin suggested that Lrp4 downregulation was successful, whereas FAK downregulation appeared to have no influence on AChR clustering.
The second part of the thesis addressed the agrin-independent MuSK activation by Wnt proteins. The goal was to establish a heterologous cell line (CHO cell line) to stably express soluble Wnt 4, 9a and 11 for further purification of recombinant Wnt. Numerous subcloning strategies, different transfection methods, differently tagged Wnt proteins and purifying optimizations were assayed. Expression and purification of Wnt proteins were achieved but obtained Wnt concentrations were too low for further experiments. In additional experiments I was able to demonstrate specific binding of Wnt4 to MuSK using co-immunoprecipitation. Finally, I examined the interaction of Wnt, MuSK and Lrp4 using co-localization studies of the three proteins on the cell surface of Cos- 7 cells.
Keywords (eng)
NMJMuSKWntWnt purificationcytoskeletal effectorsFAKDynamin2EB3Lrp4C2C12 mouse muscle cells
Keywords (deu)
NMJMuSKWntWnt Aufreinigungzytoskelett-regulierende ProteineFAKDynamin2EB3Lrp4C2C12 Maus Muskelzelllinie
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1324274
rdau:P60550 (deu)
103 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Number of pages
103
Association (deu)
Title (eng)
Characterizing Wnt proteins and cytoskeletal effectors during MuSK signaling
Author
Sandra Parzer
Abstract (deu)
Zusammenfassung
Die neuromuskuläre Synapse ist die spezialisierte Verbindung zwischen einer Muskelfaser und einem Motorneuron. Diese Synapse reguliert jegliche Art der Bewegung, inklusive der Atmung, innerhalb eines Organismus. Ein wichtiger Faktor für die erfolgreiche Synapsenbildung ist die Aktivierung der muskelspezifischen Rezeptor-Tyrosinkinase (MuSK) und die daraus folgenden Signalkaskaden bis zum Clustering von Acetylcholinrezeptoren (AChR). Die korrekte Synapsenbildung während der Embryonalentwicklung und frühen postnatalen Entwicklung ist lebensnotwendig für einen Organismus. Die postsynaptische Seite charakterisiert sich durch hochkonzentrierte AChR in „Pretzelform“, welche der präsynaptischen, aktiven Zone mit akkumulierten Acetylcholinvesikeln an der Nervenendigung gegenüber steht. Der muskelinnervierende Motornerv initiiert die Freisetzung von Agrin, einem Proteoglycan, welches zur Aktivierung von MuSK und Lrp4 führt. Die Bildung und Stabilisierung der neuromuskulären Synapse erfordert das genaue Zusammenspiel aller beteiligten molekularen Faktoren. In den letzten Jahren wurde erkannt, dass MuSK auch durch Wnt Proteine aktiviert werden kann und dass Wnt Proteine eine Rolle beim Nerv-unabhängigen Clustering von AChR spielen. Wnt Proteine erkennen und binden die cysteinreiche Domäne von MuSK, welche deren nativen Rezeptor Frizzled ähnelt, führen zu MuSK Phosphorylierung und AChR Anhäufung. Die Rolle von Wnt Proteinen und weiteren synapsenbildenden Hilfsproteinen während der AChR Clusterbildung soll in dieser Masterarbeit untersucht werden.
Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit Proteinen, die das Zytoskelett remodellieren und somit zum Proteintransport und zum Aufbau der AChR Cluster beitragen. Dynamin-2, FAK, Lrp4 und EB3 wurden mit Hilfe von RNAi herunterreguliert und dessen Auswirkung auf AChR Clusterbildung untersucht. Ziel war es, Muskelzelllinien zu etablieren, welche ein Tet-ON Expressionssystem stabil exprimieren. Somit kann die shRNA Expression mit Doxycyclinzugabe präzise gesteuert werden. In vier Proteinen konnte eine erfolgreiche Herunterregulierung in den jeweiligen Zelllinien erziehlt werden. Dynamin2, EB3 und FAK wiesen eine signifikante Knockdownrate von ca. 50% auf, Lrp4 eine Runterregulierung von etwa 40%. Allerdings zeigte nur Lrp4 knockdown eine Reduktion von AChR Clustern, bei FAK knockdown war die AChR Clusterbildung nicht beeinflusst.
Der Zweite Teil konzentrierte sich auf die Agrin-unabhängige MuSK Aktivierung durch Wnts. Wnt Proteine wurden in heterologen Zellen (CHO, Chinese Hamster Ovary cells) exprimiert und aus dem Überstand aufgereinigt. Der Fokus wurde auf die Erstellung von Wnt 4, 9a und 11 stabil exprimierenden CHO Zelllinien und die Optimierung der Proteinisolierung gelegt. Außerdem wurde die spezifische Bindung der Wnt Proteine an MuSK und deren Lokalisation in der Zelle untersucht. Wnt Proteine konnten erfolgreich angereichert werden, jedoch in zu geringer Konzentration um sie für weiterführende Versuche an C2C12 Zellen verwenden zu können. Weiters konnte die spezifische Bindung von Wnt4 an MuSK durch Ko-Immunopräzipitation gezeigt werden und Ko-lokalisation der drei interagierenden Proteine Wnt, MuSK und Lrp4 an der Zelloberfläche nachgewiesen werden.
Abstract (eng)
Abstract
The neuromuscular junction is the connection between muscle and the innervating motoneuron. Its highly specialized structure is important for muscle movement, including breathing and thus the non- or malfunction leads to severe diseases or even death. The innervating motoneuron approaches the muscle guided by the prepatterned AChR cluster region, stabilizes the clusters and leads to their ‘Pretzel’-shaped form. The presynaptic motoneuron accumulates vesicles carrying the neurotransmitter acetylcholine at the active zone, opposite of the muscle’s postsynaptic density region, where AChRs become concentrated. The motoneuron releases agrin, a proteoglycan, which diffuses through the synaptic cleft, binds to Lrp4 and leads to homodimerization of MuSK and its activation. Subsequent signaling events lead to phosphorylation of AChR-β subunit and the stabilization of AChR cluster and NMJ maturation. More recently, Wnt proteins have been implicated in MuSK activation and nerve-inpendent AChR clustering, termed prepatterning. In this thesis the role of Wnt proteins and specific cytoskeletal effectors was studied.
The focus of the first project in this thesis was set on the creation of a model system for doxycycline-induced downregulation of MuSK target proteins involved in MuSK activation, internalization, AChR clustering and cytoskeletal rearrangements. Therefore, the method of RNAi or RNA-induced silencing was applied for controlled downregulation of Dynamin-2, Lrp4, EB3 and FAK. The aim was to test target protein downregulation, differentiation of myotubes and the effect on AChR clustering in doxycycline-treated and untreated C2 myotubes. Results indicated successful downregulation of endogenous Dynamin-2, FAK and EB3 by more than 50%. Lrp4 showed a downregulation rate of approximately 40%. A reduced number of AChR clusters in response to agrin suggested that Lrp4 downregulation was successful, whereas FAK downregulation appeared to have no influence on AChR clustering.
The second part of the thesis addressed the agrin-independent MuSK activation by Wnt proteins. The goal was to establish a heterologous cell line (CHO cell line) to stably express soluble Wnt 4, 9a and 11 for further purification of recombinant Wnt. Numerous subcloning strategies, different transfection methods, differently tagged Wnt proteins and purifying optimizations were assayed. Expression and purification of Wnt proteins were achieved but obtained Wnt concentrations were too low for further experiments. In additional experiments I was able to demonstrate specific binding of Wnt4 to MuSK using co-immunoprecipitation. Finally, I examined the interaction of Wnt, MuSK and Lrp4 using co-localization studies of the three proteins on the cell surface of Cos- 7 cells.
Keywords (eng)
NMJMuSKWntWnt purificationcytoskeletal effectorsFAKDynamin2EB3Lrp4C2C12 mouse muscle cells
Keywords (deu)
NMJMuSKWntWnt Aufreinigungzytoskelett-regulierende ProteineFAKDynamin2EB3Lrp4C2C12 Maus Muskelzelllinie
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1324275
Number of pages
103
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