Synthese polykationischer Gen Transprot Systemen und deren biophysikalische Evaluation

Jakob Sperhansl

doi:10.25365/thesis.41817

You are here: University of Vienna PHAIDRA Detail o:1325647

Title (deu)

Synthesis of polycationic gene carrier systems and their biophysical evaluation

Parallel title (deu)

Synthese polykationischer Gen Transprot Systemen und deren biophysikalische Evaluation

Author

Jakob Sperhansl

Advisor

Manfred Ogris

Assessor

Manfred Ogris

Abstract (deu)

Lineares Polyethylenimin (LPEI) gehört zu den wichtigsten nicht-viralen Gentransfervektoren. Die chemische Modifizierbarkeit des Polymers, wie etwa die Möglichkeit der Einführung von Targeting-Einheiten macht es zu einem vielseitigen Werkzeug für die Gentherapie. Mischt man LPEI mit Nukleinsäuren, bilden sich durch elektrostatische Wechselwirkungen gefolgt von einem hydrophoben Kollaps Nanopartikel, sogenannte Polyplexe. Diese Nanopartikel können Zellen durch adsorptive Endozytose und die Freisetzung von DNA innerhalb der Zelle transfizieren. Wir synthetisierten Poly(2-ethyl-2-oxazoline) vier verschiedener Molekulargewichte unter der Verwendung von 2-Ethyl-2-oxazolin als Ausgangssubstanz. Mittels saurer Hydrolyse wurde lineares Polyethylenimin synthetisiert. Anstelle von GE11, ein Targeting-Peptid, das an den EGF-Rezeptor bindet ohne ihn dabei zu aktivieren wurde LPEI mithilfe eines heterobifunktionellen PEG-Linkers mit L-Cystein modifiziert. Polyplexe wurden durch Mischen von LPEI und Plasmid DNA (pDNA) Lösungen und anschließendem „Flash-Pipetting“ hergestellt. Ein wichtiger Punkt dieser Arbeit war die Untersuchung der Größe und des ζ-Potentials der Nanopartikel mittels der Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), da diese Eigenschaften direkt mit der Transfektionseffizienz und Toxizität von Polyplexen korrelieren. Unsere Ergebnisse zeigten, dass eine Erhöhung des LPEI zu Plasmid Verhältnis zu einer Abnahme der Größe und einer Erhöhung des ζ-Potentials führt. Polyplexe erzeugt bei einem N/P-Verhältnis von 3 hatten keine kinetische Stabilität. Eine Erhöhung der pDNA Konzentration und der Inkubationszeit führte zu einer Erhöhung des durchschnittlichen Durchmessers der Partikel. Auch der Verdünnungspuffer hat Einfluss auf die Größe. Polyplexe (erzeugt in HEPES-gepufferter Glucose (HBG)) wurden jeweils in HBG und RPMI 1640, verdünnt. Die Messungen ergaben, dass insbesondere bei einem N/P-Verhältnis von 9 Polyplexe verdünnt in RPMI 1640 deutlich größer waren als diejenigen in HBG verdünnt. Weiterhin sind Polyplex Eigenschaften auch abhängig vom Puffersystem, das während Nanopartikelerzeugung verwendet wird. Polyplexe, die in HEPES-gepufferter Salzlösung erzeugt wurden zeigten vermehrt Aggregatbildung, die Partikel waren im Durchschnitt dadurch größer, verglichen mit Polyplexen, die in HBG hergestellt wurden. Darüber hinaus optimierten wir ein hochskalierbares, besser reproduzierbares Verfahren zur Polyplex Herstellung. Zu diesem Zweck wurde eine Spritzenpumpe eingesetzt, da sowohl Strömungsgeschwindigkeit und die Spritzengröße einstellbar sind.

Abstract (eng)

Linear polyethylenimine (LPEI) is amongst the most important non-viral vector for gene therapy. The chemical modifiability of this polymer like the possibility of introducing targeting moieties is making it a versatile tool for gene therapy. Mixed with nucleic acids nanoparticles, so-called polyplexes, are formed due to electrostatic interactions followed by hydrophobic collapse. These nanoparticles are able to transfect cells by adsorptive endocytosis. We synthesized poly(2-ethyl-2-oxazolines) of four different molar weights using 2-ethyl-2-oxazoline as initial compound. Via acidic hydrolysis linear polyethylenimine was generated. In place of GE11, a targeting peptide which couples with the EGF receptor without activating it LPEI was modified with L-cysteine using a heterobifunctional PEG linker. Polyplexes were generated by mixing solutions of LPEI and plasmid DNA (pDNA) by flash pipetting. An important task of this thesis was the investigation of size and ζ-potential by nanoparticle tracking analysis (NTA) since these properties directly correlate with the transfection efficiency and toxicity of polyplexes. Our results showed that an increase of the LPEI to plasmid ratio leads to a decrease of size and an increase of ζ-potential. Polyplexes generated with an N/P-ratio of 3 had no kinetic stability. An increase of pDNA concentration and incubation time led to an increase of the average diameter of the particles. Also the dilution buffer has influence on size. Polyplexes (generated in HEPES buffered Glucose (HBG)) were diluted in HBG and RPMI 1640, respectively. The measurements revealed that especially at N/P-ratio of 9 polyplexes diluted in RPMI 1640 were significantly bigger than those diluted in HBG. Furthermore, polyplex properties are also dependent on the buffer system used during nanoparticle generation. Polyplexes generated in HEPES buffered saline showed increased aggregation and therefor size, compared with polyplexes generated in HBG. Moreover, an up-scaled, more reproducible method of polyplex formation was optimized. For this purpose, a syringe pump was employed, since the flowrate and syringe size is adjustable.

Keywords (eng)

linear polyethylenimineLPEInon-viralnanoparticle tracking analysisNTAgene therapysynthesisbiophysical properties

Keywords (deu)

lineares PolyethyleniminLPEInon-viralNanoparticle Tracking AnalysisNTAGentherapieSynthesebiophysikalische Eigenschaften

Subject (deu)

Biochemie: Sonstiges

Subject (deu)

Pharmazeutische Chemie

Subject (deu)

Medizinische Genetik

Type (deu)

Diplomarbeit