Abstract (deu)
Lineares Polyethylenimin (LPEI) gehört zu den wichtigsten nicht-viralen Gentransfervektoren. Die chemische Modifizierbarkeit des Polymers, wie etwa die Möglichkeit der Einführung von Targeting-Einheiten macht es zu einem vielseitigen Werkzeug für die Gentherapie. Mischt man LPEI mit Nukleinsäuren, bilden sich durch elektrostatische Wechselwirkungen gefolgt von einem hydrophoben Kollaps Nanopartikel, sogenannte Polyplexe. Diese Nanopartikel können Zellen durch adsorptive Endozytose und die Freisetzung von DNA innerhalb der Zelle transfizieren.
Wir synthetisierten Poly(2-ethyl-2-oxazoline) vier verschiedener Molekulargewichte unter der Verwendung von 2-Ethyl-2-oxazolin als Ausgangssubstanz. Mittels saurer Hydrolyse wurde lineares Polyethylenimin synthetisiert. Anstelle von GE11, ein Targeting-Peptid, das an den EGF-Rezeptor bindet ohne ihn dabei zu aktivieren wurde LPEI mithilfe eines heterobifunktionellen PEG-Linkers mit L-Cystein modifiziert.
Polyplexe wurden durch Mischen von LPEI und Plasmid DNA (pDNA) Lösungen und anschließendem „Flash-Pipetting“ hergestellt.
Ein wichtiger Punkt dieser Arbeit war die Untersuchung der Größe und des ζ-Potentials der Nanopartikel mittels der Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), da diese Eigenschaften direkt mit der Transfektionseffizienz und Toxizität von Polyplexen korrelieren.
Unsere Ergebnisse zeigten, dass eine Erhöhung des LPEI zu Plasmid Verhältnis zu einer Abnahme der Größe und einer Erhöhung des ζ-Potentials führt. Polyplexe erzeugt bei einem N/P-Verhältnis von 3 hatten keine kinetische Stabilität. Eine Erhöhung der pDNA Konzentration und der Inkubationszeit führte zu einer Erhöhung des durchschnittlichen Durchmessers der Partikel.
Auch der Verdünnungspuffer hat Einfluss auf die Größe. Polyplexe (erzeugt in HEPES-gepufferter Glucose (HBG)) wurden jeweils in HBG und RPMI 1640, verdünnt. Die Messungen ergaben, dass insbesondere bei einem N/P-Verhältnis von 9 Polyplexe verdünnt in RPMI 1640 deutlich größer waren als diejenigen in HBG verdünnt.
Weiterhin sind Polyplex Eigenschaften auch abhängig vom Puffersystem, das während Nanopartikelerzeugung verwendet wird. Polyplexe, die in HEPES-gepufferter Salzlösung erzeugt wurden zeigten vermehrt Aggregatbildung, die Partikel waren im Durchschnitt dadurch größer, verglichen mit Polyplexen, die in HBG hergestellt wurden.
Darüber hinaus optimierten wir ein hochskalierbares, besser reproduzierbares Verfahren zur Polyplex Herstellung. Zu diesem Zweck wurde eine Spritzenpumpe eingesetzt, da sowohl Strömungsgeschwindigkeit und die Spritzengröße einstellbar sind.