Title (eng)
Chemical and technical improvement of light-directed in situ microarray technology
Author
Matej Sack
Advisor
Mark Manuel Somoza
Assessor
Martin Bilban
Christopher Gerner
Abstract (deu)
Hoch komplexe in situ Microarrays, in diesem Fall von Nukleinsäuren, werden mittels der maskless array synthesis (MAS)-Technologie und lichtsensitiven Schutzgruppen synthetisiert und gehören zu den etablierten und relativ einfach handzuhabenden analytischen Werkzeugen. Im Zuge dieser Arbeit wurde es ermöglicht zwei idente – lediglich Spiegelbilder voneinander - Microarrays in nur einer Synthese auf zwei unterschiedlichen Substraten herzustellen. Wichtig dabei ist, dass beide Substrate genau in der optischen Brennebene positioniert werden. Die damit einhergehenden Vorteile beinhalten eine Halbierung der ursprünglichen Synthesezeit, sowie keinen Mehrverbrauch der Reagenzien, resultierend in Verringerung der Kosten. Ein weiterer Vorteil liegt im etwaigen Vergleich der beiden Microarrays miteinander. Des Weiteren wurden Versuche unternommen, einen wichtigen Faktor der Fehlerquellen, nämlich Streulicht, zu minimieren. Dabei ist es möglich eine extra Kammer des Halterungsapparates hinter dem Microarray mit lichtabsorbierenden Flüssigkeiten und dem Glas/Quartz ähnlichem Brechungsindex zu befüllen. Dadurch wird reflektiertes Licht reduziert und zeitgleich die richtige Sequenzausbeute erhöht. Im Verlauf der vorliegenden Arbeit wurde zusätzlich die gesamte involvierte Synthesechemie verbessert. Zum einen wurden Versuche mit den stark lichtsensitiven thiophenyl-NPPOC (SPh-NPPOC) Phosphoramiditen durchgeführt, welche die notwendige Belichtungszeit um einen Faktor von 12 reduzieren. Weitere Verbesserungen bei den Couplingzeiten, sowie des essentiellen Heliumbedarfs, verringerten ebenfalls die Synthesezeit. Zum anderen wurden unterschiedliche Aktivatoren auf ihre Effizienz und Bildhomogenität getestet und der beste Aktivator nachfolgend evaluiert. All jene Verbesserungen vereint, optimierten den gesamten Syntheseverlauf und reduzierten die Synthesezeit von Genexpressionsmicroarrays von den ursprünglichen ~ 8 h auf lediglich 1,5 h.
Abstract (eng)
Highly complex and high-throughput microarrays of biopolymers, in this case nucleic acids, synthesized using maskless array synthesis (MAS) using photosensitive protecting groups, are well-established and relatively easy to use analytical tools.
MAS started out with the ability to make one microarray per synthesis. The cell assembly complex was improved so that now two identical, mirror images arrays, can be synthesized onto two different substrates simultaneously. An important aspect is to accurately and reliably position both substrates in the focal plane, which has a focal depth of about 70 µm. Several advantages are achieved, doubling the microarray synthesis rate and halving the synthesis time and costs per array. The reagent and solvents consumption is the same as for a single array synthesis. Another advantage is a more reliable comparison between experiments using the two mirror image microarrays since the microarrays are essentially identical with one another. Additionally, the new synthesis method allows for increased sequence fidelity of the microarray oligonucleotides by suppressing one of the largest sources of stray light; an extra chamber of the cell assembly complex can be filled with an absorbing and index-matching fluid in order to decrease unwanted reflection and contributes further in optimizing the sequence fidelity outcome.
The microarray synthesis chemistry was also highly optimized by using the highly light-sensitive thiophenyl-NPPOC (SPh-NPPOC) phosphoramidites, which reduce the necessary exposure time by a factor of 12. Coupling time was additionally decreased by a factor of four, to 15 seconds. Optimizing reagent delivery and incubation times of different chemicals and the crucial helium-flow also reduced synthesis time increasingly. Different phosphoramidite activators were also tested and to determine which of them are the best in terms of picture homogeneity, minimization of oxidising solution ─ needed to stabilize the growing oligonucleotide chain ─ and least expensive. Applying all improvements to the synthesis, the time for the synthesis of a gene expression microarray could be reduced from about 8 hours to about 1.5 hours.
Keywords (eng)
microarrayin situDNARNANPPOCSPhMASnucleic acidgene expressionanalytical tool
Keywords (deu)
Microarrayin situDNARNANPPOCSPhMASNukleinsäureGenexpressionAnalysemethode
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1325854
rdau:P60550 (deu)
vi, 73 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Number of pages
81
Association (deu)
Title (eng)
Chemical and technical improvement of light-directed in situ microarray technology
Author
Matej Sack
Abstract (deu)
Hoch komplexe in situ Microarrays, in diesem Fall von Nukleinsäuren, werden mittels der maskless array synthesis (MAS)-Technologie und lichtsensitiven Schutzgruppen synthetisiert und gehören zu den etablierten und relativ einfach handzuhabenden analytischen Werkzeugen. Im Zuge dieser Arbeit wurde es ermöglicht zwei idente – lediglich Spiegelbilder voneinander - Microarrays in nur einer Synthese auf zwei unterschiedlichen Substraten herzustellen. Wichtig dabei ist, dass beide Substrate genau in der optischen Brennebene positioniert werden. Die damit einhergehenden Vorteile beinhalten eine Halbierung der ursprünglichen Synthesezeit, sowie keinen Mehrverbrauch der Reagenzien, resultierend in Verringerung der Kosten. Ein weiterer Vorteil liegt im etwaigen Vergleich der beiden Microarrays miteinander. Des Weiteren wurden Versuche unternommen, einen wichtigen Faktor der Fehlerquellen, nämlich Streulicht, zu minimieren. Dabei ist es möglich eine extra Kammer des Halterungsapparates hinter dem Microarray mit lichtabsorbierenden Flüssigkeiten und dem Glas/Quartz ähnlichem Brechungsindex zu befüllen. Dadurch wird reflektiertes Licht reduziert und zeitgleich die richtige Sequenzausbeute erhöht. Im Verlauf der vorliegenden Arbeit wurde zusätzlich die gesamte involvierte Synthesechemie verbessert. Zum einen wurden Versuche mit den stark lichtsensitiven thiophenyl-NPPOC (SPh-NPPOC) Phosphoramiditen durchgeführt, welche die notwendige Belichtungszeit um einen Faktor von 12 reduzieren. Weitere Verbesserungen bei den Couplingzeiten, sowie des essentiellen Heliumbedarfs, verringerten ebenfalls die Synthesezeit. Zum anderen wurden unterschiedliche Aktivatoren auf ihre Effizienz und Bildhomogenität getestet und der beste Aktivator nachfolgend evaluiert. All jene Verbesserungen vereint, optimierten den gesamten Syntheseverlauf und reduzierten die Synthesezeit von Genexpressionsmicroarrays von den ursprünglichen ~ 8 h auf lediglich 1,5 h.
Abstract (eng)
Highly complex and high-throughput microarrays of biopolymers, in this case nucleic acids, synthesized using maskless array synthesis (MAS) using photosensitive protecting groups, are well-established and relatively easy to use analytical tools.
MAS started out with the ability to make one microarray per synthesis. The cell assembly complex was improved so that now two identical, mirror images arrays, can be synthesized onto two different substrates simultaneously. An important aspect is to accurately and reliably position both substrates in the focal plane, which has a focal depth of about 70 µm. Several advantages are achieved, doubling the microarray synthesis rate and halving the synthesis time and costs per array. The reagent and solvents consumption is the same as for a single array synthesis. Another advantage is a more reliable comparison between experiments using the two mirror image microarrays since the microarrays are essentially identical with one another. Additionally, the new synthesis method allows for increased sequence fidelity of the microarray oligonucleotides by suppressing one of the largest sources of stray light; an extra chamber of the cell assembly complex can be filled with an absorbing and index-matching fluid in order to decrease unwanted reflection and contributes further in optimizing the sequence fidelity outcome.
The microarray synthesis chemistry was also highly optimized by using the highly light-sensitive thiophenyl-NPPOC (SPh-NPPOC) phosphoramidites, which reduce the necessary exposure time by a factor of 12. Coupling time was additionally decreased by a factor of four, to 15 seconds. Optimizing reagent delivery and incubation times of different chemicals and the crucial helium-flow also reduced synthesis time increasingly. Different phosphoramidite activators were also tested and to determine which of them are the best in terms of picture homogeneity, minimization of oxidising solution ─ needed to stabilize the growing oligonucleotide chain ─ and least expensive. Applying all improvements to the synthesis, the time for the synthesis of a gene expression microarray could be reduced from about 8 hours to about 1.5 hours.
Keywords (eng)
microarrayin situDNARNANPPOCSPhMASnucleic acidgene expressionanalytical tool
Keywords (deu)
Microarrayin situDNARNANPPOCSPhMASNukleinsäureGenexpressionAnalysemethode
Subject (deu)
Subject (deu)
Subject (deu)
Type (deu)
Persistent identifier
https://phaidra.univie.ac.at/o:1325855
Number of pages
81
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